Υποδοχή στο μοριακό σταθμό!

Πρέπει να καταχωρήσετε προτού να μπορέσετε να ταχυδρομήσετε στα φόρουμ μας ή να χρησιμοποιήσετε τα προηγμένα χαρακτηριστικά γνωρίσματά μας. Κατάλογος τώρα! Ελεύθερος και γρήγορος του!

Ήδη καταχωρημένος; Αδεια εισόδου τώρα κατωτέρω.

Όνομα χρηστών:

Κωδικός πρόσβασης:

Με θυμηθείτε;

Ήδη καταχωρημένος και ξέχασε τον κωδικό πρόσβασής σας; Χτυπήστε κατωτέρω για να το ανακτήσετε.

Ανακτήστε το χαμένο κωδικό πρόσβασης

Ενώστε τώρα - είναι γρήγορο και ελεύθερο!

Ο μοριακός σταθμός είναι το μεγαλύτερο δίκτυο ερευνητών, επιστημόνων και εραστών επιστήμης οπουδήποτε!

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

 

Πρωτεϊνικά πρωτόκολλα

Πρωτεϊνική εγκυκλοπαίδεια

Πρωτεϊνική βιοπληροφορική

Πρωτεϊνικό φόρουμ επιστήμης

Πρωτεϊνικό Blog

Ειδήσεις DNA

 

Πρωτεϊνικό πρωτόκολλο δοκιμής του Μπράντφορντ

Πρωτεϊνική συγκέντρωση Determinatino που χρησιμοποιεί τη μέθοδο δοκιμής του Μπράντφορντ

Υλικά για τη δοκιμή του Μπράντφορντ

1. Αντιδραστήριο: Το αντιδραστήριο δοκιμής γίνεται με τη διάλυση 100 mg Coomassie μπλε G250 σε 50 mL της αιθανόλης 95%. Η λύση αναμιγνύεται έπειτα με 100 mL του φωσφορικού οξέος 85% και γίνεται μέχρι 1 λ με το αποσταγμένο νερό. Το αντιδραστήριο πρέπει να φιλτραριστεί μέσω του εγγράφου φίλτρων Whatman αριθ. 1 και να καταχωρηθεί έπειτα σε ένα ηλέκτρινο μπουκάλι στη θερμοκρασία δωματίου. Είναι σταθερό για αρκετές εβδομάδες. Εντούτοις, κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου η χρωστική ουσία μπορεί να κατακρημνίσει από τη λύση και έτσι το καταχωρημένο αντιδραστήριο πρέπει να φιλτραριστεί πριν από τη χρήση.

2. Πρωτεϊνικά πρότυπα. Βοοειδής γ- η σφαιρίνη σε μια συγκέντρωση 1 mg/$l*ml (100 ΅g/$l*mL για microassay) στο αποσταγμένο νερό χρησιμοποιείται ως λύση αποθεμάτων. Αυτό πρέπει να καταχωρηθεί παγωμένος –σε 20oC. Δεδομένου ότι η περιεκτικότητα σε υγρασία της στερεάς πρωτεϊ'νης μπορεί να ποικίλει κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, η ακριβής συγκέντρωση της πρωτεϊ'νης στην πρότυπη λύση πρέπει να καθοριστεί από την απορροφητικότητά της σε 280 NM. Η απορροφητικότητα ενός 1 mg/$l*ml λύση γ- η σφαιρίνη, σε ένα ελαφρύ μονοπάτι 1-εκατ., είναι 1,35. Οι αντίστοιχες τιμές για δύο εναλλακτικά πρωτεϊνικά πρότυπα, τη λευκωματίνη βοοειδών ορών και ovalbumin, είναι 0,66 και 0,75, αντίστοιχα.

3. Το πλαστικό και τα γυαλικά που χρησιμοποιούνται στη δοκιμή πρέπει να είναι απολύτως καθαρά και απορρυπαντικό ελεύθερο. Spectrophotometer χαλαζία (πυρίτιο) οι δοκιμαστικοί σωλήνες δεν πρέπει να χρησιμοποιηθούν, όπως η χρωστική ουσία δεσμεύει σε αυτό το υλικό. Τα ίχνη χρωστικής ουσίας που δεσμεύονται στα γυαλικά ή το πλαστικό μπορούν να αφαιρεθούν με το ξέπλυμα με τη μεθανόλη ή την καθαριστική λύση.

 Πρότυπη μέθοδος δοκιμής του Μπράντφορντ

1. Εισάγετε στο σιφώνιο μεταξύ 10 και 100 ΅g της πρωτεϊ'νης ΅L στο συνολικό τόμο 100 σε έναν σωλήνα δοκιμής. Εάν η κατά προσέγγιση συγκέντρωση δειγμάτων είναι άγνωστη, δοκιμάστε μια σειρά των διαλύσεων (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Προετοιμάστε τα αντίγραφα κάθε δείγματος.

2. Για την καμπύλη βαθμολόγησης, εισάγετε στο σιφώνιο τις διπλές εντάσεις του ήχου 10 ..20 ..40 ..60 ..80, και 100 ΅L 1 mg/$l*ml γ- πρότυπη λύση σφαιρίνης στους σωλήνες δοκιμής, και κάνετε κάθε ενός μέχρι 100 ΅L με το αποσταγμένο νερό. Εισάγετε στο σιφώνιο 100 ΅L του αποσταγμένου νερού σε έναν περαιτέρω σωλήνα για να παρέχετε το κενό αντιδραστηρίων.

3. Προσθέστε 5 mL του πρωτεϊνικού αντιδραστηρίου σε κάθε σωλήνα και αναμίξτε καλά από την αντιστροφή ή εξευγενίστε. Αποφύγετε, το οποίο θα οδηγήσει στη φτωχή δυνατότητα αναπαραγωγής.

4. Μετρήστε A595 των δειγμάτων και των προτύπων κατά του κενού αντιδραστηρίων μεταξύ 2 λ. και 1 χ μετά από να αναμίξει. Τα πρότυπα 100 ΅g πρέπει να δώσουν μια A595 αξία περίπου 0,4. Η πρότυπη καμπύλη δεν είναι γραμμική, και η ακριβής απορροφητικότητα ποικίλλει ανάλογα με την ηλικία του αντιδραστηρίου δοκιμής. Συνεπώς, είναι ουσιαστικό να κατασκευαστεί μια καμπύλη βαθμολόγησης για κάθε σύνολο δοκιμών.

Microassay η μέθοδος αυτή η μορφή της δοκιμής είναι πιό ευαίσθητη στην πρωτεϊ'νη. Συνεπώς, είναι χρήσιμο όταν περιορίζεται η ποσότητα της άγνωστης πρωτεϊ'νης (δείτε επίσης τη σημείωση 9) 1. εισάγει στο σιφώνιο τα διπλά δείγματα που περιέχουν μεταξύ 1 και 10 ΅g σε μια συνολική ένταση του ήχου 100 ΅L στους σωλήνες πολυαιθυλενίου 1.5-mL microfuge. Εάν η κατά προσέγγιση συγκέντρωση δειγμάτων είναι άγνωστη, δοκιμάστε μια σειρά των διαλύσεων (1, 1:10, 1:100, 1:1000).

2. Για την καμπύλη βαθμολόγησης, εισάγετε στο σιφώνιο τις διπλές εντάσεις του ήχου 10 ..20 ..40 ..60 ..80, και 100 ΅L 100 ΅g/$l*mL γ- πρότυπη λύση σφαιρίνης στους σωλήνες microfuge, και ρυθμίστε την ένταση του ήχου σε 100 ΅L με το ύδωρ. Εισάγετε στο σιφώνιο 100 ΅L του αποσταγμένου νερού σε έναν σωλήνα για το κενό αντιδραστηρίων.

3. Προσθέστε 1 mL του πρωτεϊνικού αντιδραστηρίου σε κάθε σωλήνα και μίγμα ήπια, αλλά λεπτομερώς.

4. Μετρήστε την απορροφητικότητα κάθε δείγματος μεταξύ 2 και 60 λ. μετά από την προσθήκη του πρωτεϊνικού αντιδραστηρίου. Η A595 αξία ενός δείγματος που περιέχει 10 ΅g γ- η σφαιρίνη είναι 0,45.

δείτε επίσης: Πρωτεϊνική δοκιμή του Μπράντφορντ

Αναφορές για τη δοκιμή του Μπράντφορντ

Τροποποιημένος από το πρωτόκολλο από Nicholas J. Kruger.

Σχετικά πρωτεϊνικά άρθρα συγκέντρωσης

Πρωτεϊνική συγκέντρωση

Πρωτεϊνικό πρωτόκολλο συγκέντρωσης

Πρωτεϊνική δοκιμή Lowry

Πρωτόκολλο μεθόδου Lowry

Μέθοδος του Μπράντφορντ

Αλλες πρωτεϊνικές μέθοδοι:

Δυτικός λεκές

Immunoprecipitation