Η μοριακή βιολογία Blog


Πρωτεϊνικά πρωτόκολλα σειράς	Πρωτεϊνική βιοπληροφορική σειράς	Μάθετε για τις πρωτεϊνικές σειρές	Πρωτεϊνικά εξαρτήσεις και προϊόντα σειράς	Πρωτεϊνικό φόρουμ σειράς	Ειδήσεις Proteomic

Πρωτεϊνική βιοπληροφορική σειράς

Μάθετε για τις πρωτεϊνικές σειρές

Πρωτεϊνικά εξαρτήσεις και προϊόντα σειράς

Πρωτεϊνικές μέθοδοι ανίχνευσης Microarray και ανάλυση

Πρωτεϊ'νη και αντίσωμα Microarrays

Μέθοδοι ανίχνευσης και ανάλυση για τα τσιπ πρωτεϊ'νης και αντισωμάτων

Μέθοδοι ανίχνευσης και μη συγκεκριμένος συσχετισμός
            Ο μη συγκεκριμένος συσχετισμός στη σειρά πρέπει να ελαχιστοποιηθεί και αυτό γίνεται χαρακτηριστικά με τη βύθιση των σειρών σε έναν βασισμένο στη λευκωματίνη προσωρινό χώρο βοοειδών ορών (BSA) (31).
            Ο κατάλοιπο-συσχετισμός και η διατήρηση στις πρωτεϊνικές σειρές προχωρούν μέσω του thermodynamically οδηγημένου μηχανισμού συσχετισμών παρόμοιου με την υβριδοποίηση των στόχων νουκλεϊνικού οξέος στους ελέγχους. Εντούτοις, η ανίχνευση των συνδεδεμένων στόχων στις πρωτεϊ'νες είναι αρκετά πιό σύνθετη από αυτή της microarray ανίχνευσης DNA (9). Αυτήν την περίοδο ποικίλες μέθοδοι ανίχνευσης εξετάζονται. Παραδείγματος χάριν, ELISA χρησιμοποιήθηκε αρχικά για να ανιχνεύσει τις πρωτεϊ'νες και για τις σειρές φίλτρων (66.67) και για τις σειρές γυαλιού (68). Βασισμένες οι στο ELISA μέθοδοι ανίχνευσης έχουν το μειονέκτημα της μη-ιδιομορφίας των αλληλεπιδράσεων πρωτεϊνικός-αντισωμάτων, που οδηγούν σε πολλά ψεύτικα θετικά.   Το μαρκάρισμα ραδιοϊσοτόπου χρησιμοποιήθηκε από τη Γερμανία και λοιποί. (22), μαρκάρισμα ραδιοϊσοτόπου στο πρωτεϊνικό πρωτεϊνικό–, πρωτεϊνικό DNA–μελέτης, πρωτεϊνικές–αλληλεπιδράσεις φαρμάκων στις σειρές φίλτρων. Zhu και λοιποί. χρησιμοποιημένο μαρκάρισμα ραδιοϊσοτόπου για να διευθύνει τις δοκιμές κινάσεων των διαφορετικών υποστρωμάτων με τη χρησιμοποίηση των καθαρισμένων πρωτεϊνών κινάσεων ζύμης σε μια σειρά (36). Η συνιστώμενη μέθοδος ανίχνευσης είναι ανίχνευση φθορισμού επειδή αυτές οι μέθοδοι είναι γενικά ασφαλείς, εξαιρετικά ευαίσθητος, απλές και μπορούν να έχουν την πολύ υψηλή ανάλυση. Αυτές οι μέθοδοι ανίχνευσης είναι επίσης συμβατές με τους πρότυπους microarray σαρωτές. Γενικά, ένα τσιπ είναι καθένα που εξετάζεται άμεσα με ένα φθορισμού μόριο (π.χ. ένα fluorescently επονομαζόμενο πρωτεϊνικό ή μικρό μόριο, με τη χρησιμοποίηση ενός κολλημένου ελέγχου (π.χ. biotin), το οποίο μπορεί έπειτα να ανιχνευθεί σε ένα δεύτερο βήμα χρησιμοποιώντας ένα fluorescently επονομαζόμενο αντιδραστήριο συγγένειας (π.χ. streptavidin) (16.56). Μια άλλη φθορισμού μέθοδος μαρκαρίσματος κυλά την ενίσχυση κύκλων (RCA), η οποία είναι επίσης εξαιρετικά ευαίσθητο (32).
            Αν και τα proteomes κάτω από τη σύγκριση μπορούν να ονομαστούν σε μια συγκρίσιμη μόδα με τα fluorophores, η δυνατότητα αναπαραγωγής αυτών των χημικών αντιδράσεων είναι φτωχή και η παρέμβαση με τις αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνικός-αντισωμάτων παρουσιάζει μια πρόσθετη πολυπλοκότητα (9) Επίσης, το ανομοιόμορφο μαρκάρισμα των πρωτεϊνών μπορεί να εξεταστεί με την εκτέλεση μιας αναλογιομετρικής δοκιμής διπλός-χρώματος, όπου εσωτερικά πρότυπα είναι παρόντα για κάθε πρωτεϊ'νη στόχων που μετριέται (9).          Ένα μειονέκτημα του μαρκαρίσματος των πρωτεϊνών με τα fluorophores είναι μια μείωση της ποσοτικής ακρίβειας της δοκιμής, δεδομένου ότι η ενσωμάτωση της ετικέτας μπορεί να αλλάξει τις δεσμευτικές ιδιότητες των πρωτεϊνών (9).

Αν και οι άμεσες πρωτεϊνικές μέθοδοι ανίχνευσης μαρκαρίσματος ακόμα ευρέως χρησιμοποιούνται, τα εγγενή προβλήματα αναφερθέντα έχουν οδηγήσει στην αυξανόμενη χρήση των ελεύθερων μεθόδων ανίχνευσης ετικετών για την πρωτεϊ'νη microarrays. Αυτές οι μέθοδοι είναι μαζική φασματομετρία (MS), ατομική μικροσκόπηση δύναμης (AFM) (70), και plasmon επιφάνειας αντήχηση (SPR) (71).
Οι μέθοδοι μη-μαρκαρίσματος έχουν τα πλεονεκτήματα ως άμεση προσέγγιση ανίχνευσης για το αντίσωμα microarrays δεδομένου ότι το μαρκάρισμα των μορίων έχει επιπτώσεις στην πρωτεϊνική δραστηριότητα. (Επιφάνεια-ενισχυμένοι εκρόφηση/ιονισμός λέιζερ) η μαζική SELDI φασματομετρία έχει χρησιμοποιηθεί για να ανιχνεύσει ότι οι low-density σειρές συλλήφθείων πρωτεϊνών πρωτεϊνών (69). συλλαμβάνονται σε μια σειρά επιφάνειας μετάλλων (πρωτεϊνική σειρά SELDI) και είναι η χρησιμοποίηση μιας ακτίνας λέιζερ. Η ανάλυση που χρησιμοποιεί τα στοιχεία μαζικής φασματομετρίας εκτελείται έπειτα προκειμένου να αποκαλυφθούν οι ταυτότητες αυτών των πρωτεϊνών.

Η ατομική μέθοδος μικροσκόπησης δύναμης (AFM) χρησιμοποιεί τις τοπολογικές αλλαγές επιφάνειας για να προσδιορίσει τις συλλήφθείες πρωτεϊ'νες σε μια σειρά αντισωμάτων (70). Όταν το κουνέλι IgG ακινητοποιείται σε μια χρυσή επιφάνεια και δεσμεύει στα φιλοφρονητικά αντισώματά του, το μυρμήγκι-κουνέλι IgG, AFM αιγών ανιχνεύει την αύξηση στο ύψος, και είναι σε θέση έτσι να μετρήσει τις δεσμευτικές αλληλεπιδράσεις. Εντούτοις προκειμένου να μελετηθούν οι κινητικές των αλληλεπιδράσεων–αντισωμάτων αντιγόνων, οι σε πραγματικό χρόνο μέθοδοι ανίχνευσης θα είναι χρήσιμες. Plasmon επιφάνειας η αντήχηση (SPR) έχει ωριμάσει σε ένα ευπροσάρμοστο εργαλείο ανίχνευσης για να μελετήσει τις κινητικές των αλληλεπιδράσεων–δεκτών ligand με ένα ευρύ φάσμα των μοριακών βαρών, των συγγενειών και των δεσμευτικών ποσοστών (72-74). Τα εμπορικά τσιπ SPR είναι διαθέσιμα εντούτοις το ψήφισμα ανίχνευσής τους είναι περιορισμένο. Μια επιφάνεια αισθητήρων με 64 μεμονωμένες περιοχές ακινητοποίησης σε ένα ενιαίο κύτταρο ροής αναπτύχθηκε (75). Ένας βιοαισθητήρας σειράς αντισωμάτων αναπτύχθηκε επίσης για να μελετήσει τις κινητικές του αντιγόνου που δεσμεύει χρησιμοποιώντας έναν επίπεδο κυματοδηγό ως μέθοδο ανίχνευσης. Χρησιμοποιώντας αυτήν την μέθοδο, η ομάδα κατέδειξε ότι η σημαντική ένταση σημάτων θα μπορούσε να επιτευχθεί από τα σημεία τόσο μικρά όπως 200 χιλ. στη διάμετρο. Επομένως αναμένεται ότι αυτή η προσέγγιση θα είναι κατάλληλη για την υψηλός-ρυθμοαπόδοση και τις παράλληλες μελέτες κινητικών. (76).

Ακτίνα ανίχνευσης
Μια άλλη διαφορά μεταξύ της πρωτεϊ'νης και του DNA microarrays είναι ότι οι πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις σε ένα ενιαίο βιολογικό δείγμα ή τα κύτταρα είναι διάφορες κατατάξεις του magnitute μεγαλύτερες από αυτή για mRNAs. Κατά συνέπεια τα πρωτεϊνικά συστήματα ανιχνευτών τσιπ πρέπει να έχουν μια πολύ μεγάλη σειρά της λειτουργίας ανίχνευσης – μέχρι έναν παράγοντα 1014, έναντι σε 104 για mRNA. Κατά συνέπεια ένα αντίσωμα με την nanomolar συγγένεια σε έναν ιδιαίτερο στόχο θα διαποτιστεί από την παρουσία αυτού του στόχου στις micromolar συγκεντρώσεις και θα αποτύχει να ανιχνεύσει το pico - ή femtomolar στόχων επίπεδα. Προσαρμογής κατά συνέπεια οι σπάνιες και άφθονες πρωτεϊ'νες θα απαιτήσουν πιθανώς τις χωριστές σειρές (7.8.9).
Τα πολλαπλάσια αντισώματα με τις ποικίλες συγγένειες για το στόχο μπορούν να τοποθετηθούν στους διαφορετικούς τομείς της σειράς εντούτοις οι μελέτες έχουν δείξει ότι μόνο 20% των παραταγμένων αντισωμάτων παρέχουν τις μετρήσεις των πρωτεϊνών στις χαμηλές συγκεντρώσεις (33).

Έπειτα: Πρωτεϊνική παραγωγή για τις πρωτεϊνικές σειρές

Αναφορές για την πρωτεϊ'νη και το αντίσωμα Microarrays

Σε:

Εισαγωγή και υπόβαθρο στα πρωτεϊνικά τσιπ και τα τσιπ αντισωμάτων.

Τύποι αντισωμάτων και πρωτεϊνικών τσιπ

Στείλετε αυτήν την σελίδα σε έναν φίλο

Βιοπληροφορική, πρωτόκολλα, RNA πρωτεϊνικό Proteomics DNA

Ενδοκυτταρικοί σταθμοί

Πρωτεϊνικά πρωτόκολλα σειράς

Πρωτεϊνική βιοπληροφορική σειράς

Μάθετε για τις πρωτεϊνικές σειρές

Πρωτεϊνικά εξαρτήσεις και προϊόντα σειράς

Πρωτεϊνικό φόρουμ σειράς

Ειδήσεις Proteomic

Πρωτεϊνικές μέθοδοι ανίχνευσης Microarray και ανάλυση

Μέθοδοι ανίχνευσης και ανάλυση για τα τσιπ πρωτεϊ'νης και αντισωμάτων