Υποδοχή στο μοριακό σταθμό!

Πρέπει να καταχωρήσετε προτού να μπορέσετε να ταχυδρομήσετε στα φόρουμ μας ή να χρησιμοποιήσετε τα προηγμένα χαρακτηριστικά γνωρίσματά μας. Κατάλογος τώρα! Ελεύθερος και γρήγορος του!

Ήδη καταχωρημένος; Αδεια εισόδου τώρα κατωτέρω.

Όνομα χρηστών:

Κωδικός πρόσβασης:

Με θυμηθείτε;

Ήδη καταχωρημένος και ξέχασε τον κωδικό πρόσβασής σας; Χτυπήστε κατωτέρω για να το ανακτήσετε.

Ανακτήστε το χαμένο κωδικό πρόσβασης

Ενώστε τώρα - είναι γρήγορο και ελεύθερο!

Ο μοριακός σταθμός είναι το μεγαλύτερο δίκτυο ερευνητών, επιστημόνων και εραστών επιστήμης οπουδήποτε!

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

Pcr πρωτόκολλα	Pcr βιοπληροφορική και βάσεις δεδομένων	Μάθετε για pcr	Pcr εξαρτήσεις και προϊόντα	Pcr φόρουμ	Pcr βιβλία

Επιτυχείς pcr όροι

Παράμετροι για επιτυχές pcr

Υπάρχετε τα προβλήματα επιτυχές pcr;  Πολλοί παράγοντες μπορούν να έχουν επιπτώσεις στην έκβαση pcr σας σας όπως: Ιονικά cofactors μετάλλων, υπόστρωμα και ανάλογα υποστρωμάτων, προσωρινοί χώροι και άλατα και Cosolvents.  Επίσης θερμικές εκτιμήσεις ανακύκλωσης:  Pcr σκάφη, βελτιστοποίηση θερμοκρασίας και χρόνου, pcr κύκλοι ενίσχυσης, ένζυμο/στόχος και καυτή έναρξη. 

Ιονικά cofactors μετάλλων και pcr

Ουσιαστικό cofactor για την πολυμεράση DNA pcr είναι χλωρίδιο μαγνήσιου.  Η συγκέντρωσή της πρέπει να βελτιστοποιηθεί για κάθε σύστημα primer:template. Πολλά συστατικά της αντίδρασης δεσμεύουν το ιόν μαγνήσιου, συμπεριλαμβανομένων των εγχυτήρων, του προτύπου, pcr των προϊόντων και dNTPs. Ο βασικός πράκτορας συσχετισμών 1:1 για το ιόν μαγνήσιου είναι η υψηλή συγκέντρωση dNTPs στην αντίδραση. Επειδή είναι απαραίτητο για το ελεύθερο ιόν μαγνήσιου να χρησιμεύσει ως ενζυμικό cofactor pcr, η συνολική ιονική συγκέντρωση μαγνήσιου πρέπει να υπερβεί τη συνολική συγκέντρωση dNTP. Χαρακτηριστικά, για να αρχίσει τη διαδικασία βελτιστοποίησης, mM το χλωρίδιο μαγνήσιου 1,5 προστίθεται pcr παρουσία 0,8 mM συνολικού dNTPs. Αυτό αφήνει περίπου 0,7 mM ελεύθερο μαγνήσιο για την πολυμεράση DNA. Γενικά, το ιόν μαγνήσιου πρέπει να ποικληθεί σε μια σειρά συγκέντρωσης από 1,5–4,0 mM σε 0,5 mM βήματα.

Υποστρώματα και ανάλογα υποστρωμάτων για pcr

Οι πολυμεράσεις DNA ενσωματώνουν πολύ αποτελεσματικά dNTPs.  Μπορούν επίσης να ενσωματώσουν τα τροποποιημένα υποστρώματα, όταν χρησιμοποιούνται ως συμπληρωματικά συστατικά pcr. Τα παραδείγματα των υποστρωμάτων που χρησιμοποιούνται για την πολυμεράση DNA είναι: Δηγοξηγενην- DUTP, ψηοτην-11- dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, και fluorescently επονομαζόμενο dNTPs. Για συμβατικό pcr, η συγκέντρωση dNTPs παραμένει ισορροπημένη σε equimolar αναλογίες, π.χ., 200 μμ κάθε dNTP. Επίσης σημειώστε ότι, οι αποκλίσεις από αυτές τις πρότυπες συστάσεις μπορούν να είναι ευεργετικές σε ορισμένα amplications. Παραδείγματος χάριν, όταν επιδιώκεται η τυχαία μεταλλαξιγένεση ενός συγκεκριμένου στόχου, οι θιγμένες συγκεντρώσεις dNTP προωθούν έναν υψηλότερο βαθμό misincorporations από την πολυμεράση DNA.

Προσωρινοί χώροι και άλατα για pcr

Ανάλογα με το DNA η πολυμεράση χρησιμοποίησε τη βέλτιστη pcr συγκέντρωση προσωρινών χώρων, αλατισμένη συγκέντρωση, και το pH πρέπει να επιλεχτεί αναλόγως στην πολυμεράση DNA. Ο pcr προσωρινός χώρος για την πολυμεράση DNA Taq αποτελείται από 50 mM KCl και 10 mM τρης- HCl, pH 8,3, στη θερμοκρασία δωματίου. Αυτός ο προσωρινός χώρος παρέχει την ιοντική δύναμη και την αποθηκεύοντας ικανότητα που απαιτούνται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η αλατισμένη συγκέντρωση έχει επιπτώσεις στο TM του ντούμπλεξ primer:template, και ως εκ τούτου η ανοπτώντας θερμοκρασία.

Cosolvents

Διαφορετικό pcr Cosolvents χρησιμοποιείται για να αυξήσει την παραγωγή, την αποτελεσματικότητα, και την ιδιομορφία pcr των ενισχύσεων. Αυτά τα cosolvents μπορούν να είναι συμφέροντα σε μερικές ενισχύσεις, και ασύμφορα σε άλλες ενισχύσεις. Είναι αδύνατο να προβλεφθεί ποια πρόσθετη ουσία θα είναι χρήσιμη για κάθε ντούμπλεξ primer:template και επομένως ο cosolvent πρέπει να εξεταστεί εμπειρικά για κάθε συνδυασμό.

Θερμικές εκτιμήσεις ανακύκλωσης

Pcr σκάφη

Pcr πρέπει να εκτελεσθεί στα σκάφη που είναι συμβατά με τα χαμηλά ποσά ενζύμου και νουκλεϊνικών οξέων και που έχουν τα καλά θερμικά χαρακτηριστικά μεταφοράς. Συνήθως, το πολυπροπυλένιο χρησιμοποιείται για pcr τα σκάφη και οι συμβατικοί, thick-walled σωλήνες microcentrifuge επιλέγονται για πολλά θερμικά συστήματα cycler. Pcr ο συχνότερα εκτελείται 10–κλίμακα μαντίδρασης 100 λ και απαιτεί την πρόληψη των διαδικασιών εξάτμισης/συμπύκνωσης στον κλειστό σωλήνα αντίδρασης κατά τη διάρκεια της θερμικής ανακύκλωσης. Ένα στρώμα επικαλύψεων ή κεριών ορυκτελαίου εξυπηρετεί αυτόν τον σκοπό. Πιό πρόσφατα, τα με λεπτούς τοίχους σκάφη 0.2-mL έχουν βελτιστοποιηθεί για τη pcr διαδικασία και τα oil-free θερμικά cyclers έχουν σχεδιαστεί που χρησιμοποιούν μια θερμαμένη κάλυψη πέρα από τους σωλήνες που κρατιούνται μέσα στην ομάδα δεδομένων δειγμάτων.

Βελτιστοποίηση θερμοκρασίας και του κύκλος ζωών

Είναι ουσιαστικό ότι τα μίγματα αντίδρασης φθάνουν στην αλλοίωση, την ανόπτηση, και τις θερμοκρασίες επέκτασης σε κάθε θερμικό κύκλο. Εάν ο ανεπαρκής χρόνος λαβής προσδιορίζεται σε οποιαδήποτε θερμοκρασία, η θερμοκρασία του δείγματος δεν θα εξισορροπηθεί με αυτήν της ομάδας δεδομένων δειγμάτων. Κάποιο θερμικό cycler σχεδιάζει το χρόνο το διάστημα λαβής βασισμένο στη θερμοκρασία ομάδων δεδομένων, ενώ άλλοι βασίζουν το χρόνο λαβής στην προβλεφθείσα θερμοκρασία δειγμάτων. Εάν ένας συμβατικός thick-walled σωλήνας χρησιμοποίησε σε ένα cycler που ελέγχθηκε από τη θερμοκρασία ομάδων δεδομένων, ένας χρόνος λαβής της δεκαετίας του '60 είναι αρκετός για την ισορρόπηση. Ο πρόσθετος χρόνος μπορεί να συστηθεί στο βήμα επέκτασης (72°C) για τα μακρύτερα pcr προϊόντα. Χρησιμοποιώντας έναν με λεπτούς τοίχους σωλήνα 0.2-mL σε ένα cycler που ελέγχεται από την προβλεφθείσα θερμοκρασία δειγμάτων, μόνο 15 s απαιτούνται. Για να χρησιμοποιήσει τα υπάρχοντα πρωτόκολλα ή στα πρωτόκολλα ανάπτυξης για τη χρήση στα πολλαπλάσια εργαστήρια, είναι πολύ σημαντικό να επιλεχτούν οι χρόνοι λαβής σύμφωνα με το σχέδιο cycler και το πάχος τοίχων σωλήνων.

Pcr αριθμός κύκλων ενίσχυσης

Ο αριθμός pcr κύκλων ενίσχυσης πρέπει να βελτιστοποιηθεί όσον αφορά την αρχική συγκέντρωση του DNA στόχων. Συστήνεται ότι, από 40– 45 κύκλους για να ενισχύσει 50 μόρια στόχων, και 25–30 κύκλους για να ενισχύσει 3 × 105 μόρια στην ίδια συγκέντρωση. Αυτή η μη-αναλογικότητα προκαλείται από μια αποκαλούμενη επίδραση οροπέδιων, στην οποία μια μείωση στο εκθετικό ποσοστό συσσώρευσης προϊόντων εμφανίζεται στα προχωρημένα στάδια pcr. Αυτό μπορεί να προκληθεί από την υποβάθμιση των αντιδραστηρίων (dNTPs, ένζυμο) μείωση αντιδραστηρίου (εγχυτήρες, dNTPs) παρεμπόδιση τελικών προϊόντων (pyrophosphate σχηματισμός) ανταγωνισμός για τα αντιδραστήρια από τα μη συγκεκριμένα προϊόντα ή ανταγωνισμός για τη δέσμευση εγχυτήρων με του συγκεντρωμένου (10 nM) προϊόντος. Είναι συνήθως ενδεδειγμένο να τρεχτεί ο ελάχιστος αριθμός κύκλων που απαιτούνται να δει το επιθυμητό συγκεκριμένο προϊόν, επειδή τα ανεπιθύμητα μη συγκεκριμένα προϊόντα θα παρέμβουν εάν ο αριθμός κύκλων είναι υπερβολικός.

 Ένζυμο/στόχος

Σε ένα πρότυπο υποπολλαπλάσιο της πολυμεράσης DNA Taq που χρησιμοποιείται για μια αντίδρασημ100- λ, υπάρχουν περίπου 1010 μόρια. Κάθε pcr δείγμα πρέπει να αξιολογηθεί για τον αριθμό αντιγράφων στόχων που περιέχει ή μπορεί να περιέχει. Παραδείγματος χάριν, 1 NG του DNA λάμδα περιέχει 1,8 × 107 αντίγραφα. Για pcr αριθμού αντιγράφων χαμηλός-εισόδου, το ένζυμο γίνεται περιοριστικό και μπορεί να είναι απαραίτητο να δοθεί στη διαδικασία επέκτασης επαυξητικά περισσότερος χρόνος. Τα θερμικά cyclers μπορούν σοβαρά να εκτελέσουν αυτήν την αυτόματη διαδικασία επέκτασης τμήματος μνήμης προκειμένου να μεγιστοποιηθεί pcr η παραγωγή.

Καυτοί όροι έναρξης

Όλες οι ανωτέρω βελτιστοποιήσεις ισχύουν επίσης για pcr που σχεδιάζεται, από την αρχή, με μια καυτή μέθοδο έναρξης. Συχνά, μια καυτή έναρξη μπορεί να ενσωματωθεί επιτυχώς προηγουμένως βελτιστοποιημένο pcr χωρίς αλλαγή των όρων αντίδρασης. Εντούτοις, πληρώνει συνήθως μετά από να προσθέσει μια καυτή έναρξη. Η βελτιστοποίηση είναι συχνά μια ισορροπία μεταξύ της παραγωγής όσο το δυνατόν περισσότερου προϊόντος και της υπερπαραγωγής μη συγκεκριμένης, ενισχύσεις υποβάθρου. Επειδή η καυτή έναρξη μειώνει πολύ τις ενισχύσεις υποβάθρου, οι ανώτεροι περιορισμοί αυξάνονται στους όρους όπως η ενζυμική συγκέντρωση, ο αριθμός κύκλων, και η ιονική cofactor μετάλλων συγκέντρωση. Ευαίσθητο PCRs που έχει συντονιστεί ιδιαίτερα χωρίς μια καυτή έναρξη μπορεί να αποτύχει όταν προστίθεται μια καυτή έναρξη. Αυτό μπορεί να προκληθεί από τις μικρές καθυστερήσεις στους πρόωρους κύκλους που προκαλούνται από τη μίξη ή την ενζυμική ενεργοποίηση. Pcr μπορεί συνήθως να αποκατασταθεί, συχνά με την ουσιαστική αύξηση στο συγκεκριμένο προϊόν, με απλά να αυξηθεί περιοριστικός τις παραμέτρους ή τα αντιδραστήρια. Επιπλέον, υπάρχουν βελτιστοποιήσεις συγκεκριμένες για κάθε καυτή μέθοδο έναρξης. Η μίξη ή η ενζυμική ενεργοποίηση μπορεί να επηρεαστεί από pcr την ένταση του ήχου, τη σύνθεση προσωρινών χώρων και το pH, cosolvents, όροι ανακύκλωσης, και τα λοιπά. Η συγκεκριμένη λογοτεχνία’προϊόντων s, συχνά ένα ένθετο προϊόντων, πρέπει να ερωτηθεί για τις πληροφορίες για αυτές τις εκτιμήσεις.