Βιοπληροφορική, πρωτόκολλα, RNA πρωτεϊνικό Proteomics DNA

σπίτι > pcr > ιστορία-$$$-ΠΘΡ > index.php

Pcr πρωτόκολλα	Pcr βιοπληροφορική και βάσεις δεδομένων	Μάθετε για pcr	Pcr εξαρτήσεις και προϊόντα	Pcr φόρουμ	Pcr βιβλία

Ιστορία και ανάπτυξη της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσεων (pcr)

Επίσησpcr επίσκεψης σταθμός

Πνευματικά δικαιώματα 2006 MolecularStation

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων - pcr

Πίνακας περιεχομένων:

Εισαγωγή pcr - αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων 

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων (pcr)

Pcr, μια έννοια που ανακαλύπτεται

Γενικές αρχές pcr

Πολυμεράσεις/ιδιομορφία και αποδοτικότητα αντίδρασης

Βοήθημα pcr

Pcr και μοριακή κλωνοποίηση

Misincorporation: Σφάλματα των in vitro συστημάτων

Ιδιομορφία αντίδρασης

Σημαντικά πλεονεκτήματα pcr ως μέθοδο κλωνοποίησης περιλαμβάνουν την ταχύτητα, την ευαισθησία, και την ευρωστία του

Περιορισμοί pcr

Όργανα για pcr

Oligonucleotide σύνθεση

Σχέδιο εγχυτήρων

Pcr σήμερα

Pcr θα αντικατασταθεί πάντα; – Χεληθασε-εξαρτώμενη ενίσχυση (HDA)

Εισαγωγή pcr - αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων 

            Περισσότερο από 30 έτη πριν, η εισαγωγή της ανασυνδυαζόμενης τεχνολογίας DNA ως εργαλείο για τις βιολογικές επιστήμες ξεσήκωσε τη μελέτη της ζωής.  Η μοριακή κλωνοποίηση επέτρεψε τη μελέτη των μεμονωμένων γονιδίων των οργανισμών διαβίωσης εντούτοις αυτή η τεχνική εξαρτήθηκε από τη λήψη μιας σχετικά μεγάλης ποσότητας του καθαρού DNA.  Αυτό εξαρτήθηκε από την αντένσταση του DNA των πλασμιδίων ή άλλων διανυσμάτων κατά τη διάρκεια της κυτταροδιαίρεσης των μικροοργανισμών (1).  Οι ερευνητές το βρήκαν εξαιρετικά επίμοχθο και δύσκολο να λάβουν ένα συγκεκριμένο DNA σε ποσότητα από τη μάζα των γονιδίων παρόντων σε ένα βιολογικό δείγμα (2).   Η ανασυνδυαζόμενη τεχνολογία DNA κατέστησε πιθανή την πρώτη μοριακή ανάλυση και την προγενέθλια διάγνωση διάφορων ανθρώπινων ασθενειών.  Το εμβρυϊκό DNA που λήφθηκε από τη δειγματοληψία αμνιοκέντησης θα μπορούσε να αναλυθεί από την ενζυμική πέψη περιορισμού, την ηλεκτροφόρηση, τη νότιες μεταφορά και την υβριδοποίηση σε ένα κλωνοποιημένο γονίδιο ή oligonucleotide τους ελέγχους (3).  Εντούτοις, το νότιο λέκιασμα επέτρεψε μόνο τη στοιχειώδη χαρτογράφηση των γονιδίων στα ανεξάρτητα άτομα (4). 

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων (pcr)

Pcr, ένα αρκτικόλεξο για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων (5.6), επέτρεψε την παραγωγή των μεγάλων ποσοτήτων ενός συγκεκριμένου DNA από ένα σύνθετο πρότυπο DNA σε μια απλή ενζυματική αντίδραση.  Pcr είναι μια πρόσφατα αναπτυγμένη διαδικασία για την in vitro ενίσχυση του DNA.  Pcr έχει μετασχηματίσει τον τρόπο ότι σχεδόν όλες οι μελέτες που απαιτούν το χειρισμό των τεμαχίων DNA μπορούν να εκτελεσθούν ως τα αποτελέσματα της απλότητας και της χρησιμότητάς της (7). 
Στη δεκαετία του '80, Kary Mullis (σχήμα 1) και μια ομάδα των ερευνητών στην εταιρία Cetus στην εταιρία Cetus που συλλαμβάνονται ενός τρόπου να αρχιστεί και να σταματηθεί η ενέργεια μιας πολυμεράσης στα συγκεκριμένα σημεία κατά μήκος ενός ενιαίου σκέλους του DNA.  Το Mullis επίσης συνειδητοποίησε ότι με την εκμετάλλευση αυτού του συστατικού της μοριακής τεχνολογίας αναπαραγωγής, το DNA στόχων θα μπορούσε να ενισχυθεί εκθετικά.  Αυτή η διαδικασία ενίσχυσης DNA βασίστηκε σε έναν in vitro παρά μια in vivo διαδικασία (5.6.8).  Η χωρίς κύτταρα ενίσχυση DNA από pcr ήταν σε θέση να απλοποιήσει πολλές από τις πρότυπες διαδικασίες για, και τα νουκλεϊνικά οξέα (1).  Οι προηγούμενες τεχνικές για ένα συγκεκριμένο κομμάτι του DNA στηρίχθηκαν στο γονίδιο κλωνοποιώντας – μια κουραστική και αργή διαδικασία.  Pcr, αφ' ετέρου kerry Mullis που δηλώνεται “σας δίνει να επιλέξετε το κομμάτι του DNA εσείς’σχετικά με ενδιαφερόμενο και τόσο ένα μεγάλο μέρος από το καθώς θέλετε” (2.8).   Όταν άλλοι επιστήμονες Cetus πέτυχαν τελικά στην παραγωγή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσεων να εκτελέσει όπως επιδιώκεται σε μια αξιόπιστη μόδα, είχαν μια πάρα πολύ ισχυρή τεχνική για ουσιαστικά τις απεριόριστες ποσότητες των ακριβών γενετικών υλικών μοριακών βιολόγων και άλλοι που απαιτήθηκαν για την εργασία τους (8).  Από την πρώτη έκθεση in1985, περισσότερα από 5000 επιστημονικά έγγραφα δημοσιεύθηκαν μέχρι το 1992 (1).  Επιπλέον, ο μεγάλος αριθμός δημοσιεύσεων το καθιστά φυσικά αδύνατο να αναθεωρήσει όλες τις σημαντικές συνεισφορές στην ανάπτυξη και την εφαρμογή pcr της τεχνολογίας εντούτοις θα προσπαθήσουμε να αναθεωρήσουμε εδώ τις σημαντικότερες εξελίξεις στην πρακτική βασικό pcr. 

Pcr, μια έννοια που ανακαλύπτεται

Pcr συλλήφθηκε πιθανά από το Δρ Kerry Mullis το 1983 εργαζόμενο στην εταιρία Cetus σε Emeryville, ασβέστιο.  Εντούτοις, κάποια πρωτοποριακή εργασία έγινε επίσης από Gobind Khorana το 1971 ποιος περιέγραψε μια βασική αρχή ένα κομμάτι του DNA χρησιμοποιώντας δύο εγχυτήρες.  Η πρόοδος έπειτα περιορίστηκε από τα ζητήματα καθαρισμού σύνθεσης και πολυμεράσεων εγχυτήρων (9).   Στο κεφάλι’Mullis s, η εφεύρεση αυξήθηκε από ένα θεωρητικό σχέδιο να εκτελεσθεί η περιορισμένη αλληλοuχία dideoxynucleotide των μοναδικών ανθρώπινων γονιδίων χρησιμοποιώντας συνθετικά oligonucleotides με σκοπό τη διάγνωση των κοινών ανθρώπινων μεταλλαγών ασθενειών.  Ένα προφανές εμπόδιο σε μια τέτοια άμεση στρατηγική αλληλοuχίας ήταν η υψηλή πολυπλοκότητα του ανθρώπινου γονιδιώματος (3,3 Θ*Ξ 109 ζευγάρια βάσεων).  Κατά συνέπεια, δεύτερος oligonucleotide ή ένας εγχυτήρας προστέθηκε για να εμποδίσει την πρόοδο της σύνθεσης του πρώτου εγχυτήρα.   Αργότερα εντούτοις, αυτός ο δεύτερος εγχυτήρας συμπεριλήφθηκε για να δεσμεύσει στο άλλο σκέλος DNA, έτσι ώστε κάθε σκέλος του αλληλόμορφου γονιδίου μεταλλάξεων θα συνέβαλλε στο ενδεχόμενο σήμα.  Εάν το σχέδιο που περιλαμβάνει την ταυτόχρονη υβριδοποίηση των εγχυτήρων σε κάθε σκέλος τροποποιήθηκε με τη θέρμανση του μίγματος και έπειτα την επανάληψη των βημάτων ανόπτησης και επέκτασης, κατόπιν το αρχικό σήμα θα αυξανόταν ακόμα περαιτέρω.  Η επανάληψη των βημάτων θα επέτρεπε στα προϊόντα του πρώτου κύκλου για να αναπαραχθεί στο δεύτερο κύκλο, για να παραγάγει δύο αντίγραφα.  Η επανάληψη του κύκλου πάλι θα οδηγούσε σε τέσσερα αντίγραφα, κ.λπ..  Αρκετές εβδομάδες που πέρασαν πριν από αυτήν την μεγάλη ιδέα προσπαθήθηκαν (8).  Δύο εγχυτήρες ήταν συντεθειμένοι για να συμπληρώσουν τέλεια κάθε τέλος της περιοχής ζευγαριού 110 βάσεων ενός κλωνοποιημένου τμήματος μνήμης του ανθρώπινου γονιδίου β-γλοψην, η ενίσχυση εκτελέσθηκε, και τα προϊόντα προσδιορίστηκαν από την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων ακρυλαμιδών.  Το τελικό αποτέλεσμα ήταν το προσδοκώμενο τεμάχιο DNA ζευγαριού 110 βάσεων και η αρχή pcr ως βασική τεχνική στη μοριακή βιολογία (5.6).
Στην αρχική pcr Mullis διαδικασία (5,6,8), το ένζυμο χρησιμοποιήθηκε in vitro (σε ένα ελεγχόμενο περιβάλλον έξω από έναν οργανισμό).  Το double-stranded DNA χωρίστηκε σε δύο ενιαία σκέλη με τη θέρμανση του σε 96°C.  Σε αυτήν την θερμοκρασία, εντούτοις, η πολυμεράση DNAE.Coli καταστράφηκε έτσι ώστε το ένζυμο έπρεπε να ξαναγεμιστεί μετά από το στάδιο θέρμανσης κάθε κύκλου.  Η αρχική pcr του Mullis διαδικασία ήταν πολύ ανεπαρκής δεδομένου ότι απαίτησε πολύ χρόνο, απέραντα ποσά DNA-POLYMERA'SIS, και συνεχούς προσοχής σε όλη τη pcr διαδικασία.

Γενικές αρχές pcr

            Η εξέταση του pcr μηχανισμού ενίσχυσης αποκαλύπτει την απλότητά της αλλά και την κομψότητά της (σχήμα 2).  Oligonucleotide οι εγχυτήρες σχεδιάζονται αρχικά για να συμπληρώσουν τις άκρες της ακολουθίας που ενισχύεται, και που αναμιγνύεται έπειτα στη μοριακή υπερβολή με το πρότυπο DNA και deoxyribonucleotides σε έναν κατάλληλο προσωρινό χώρο.  Μετά από τη θέρμανση για να μετουσιώσουν τα αρχικά σκέλη και την ψύξη για να προωθήσουν την ανόπτηση εγχυτήρων, oligonucleotides κάθε ένα δεσμεύουν σε ένα διαφορετικό σκέλος του τεμαχίου στόχων.  Οι εγχυτήρες τοποθετούνται έτσι ώστε όταν επεκτείνεται κάθε ένας από την ενέργεια μιας πολυμεράσης DNA, τα πρόσφατα συντεθειμένα σκέλη θα επικαλύψουν την περιοχή συσχετισμών αντίθετο oligonucleotide.  Δεδομένου ότι η διαδικασία της αλλοίωσης, της ανόπτησης, και της επέκτασης πολυμεράσεων συνεχίζεται οι εγχυτήρες δεσμεύουν επανειλημμένα και στο αρχικό πρότυπο DNA και στις συμπληρωματικές περιοχές στα πρόσφατα συντεθειμένα σκέλη και επεκτείνονται για να παραγάγουν τα νέα αντίγραφα του DNA (σχήμα 3).  Το τελικό αποτέλεσμα είναι μια εκθετική αύξηση στο συνολικό αριθμό τεμαχίων DNA που περιλαμβάνουν τις ακολουθίες μεταξύ των pcr εγχυτήρων, οι οποίοι αντιπροσωπεύονται τελικά σε μια θεωρητική αφθονία 2n, όπου το ν είναι ο αριθμός κύκλων (1.7.13).

Πολυμεράσεις/ιδιομορφία και αποδοτικότητα αντίδρασης

Μια πολυμεράση DNA είναι ένα ένζυμο φυσικά εμφάνισης, ένα βιολογικό μακρομόριο που καταλύει το σχηματισμό και την επισκευή του DNA. Λειτουργεί με τη δέσμευση σε ένα ενιαίο σκέλος DNA και τη δημιουργία ενός συμπληρωματικού σκέλους.  Η ακριβής αντένσταση όλου του θέματος διαβίωσης εξαρτάται από αυτήν την δραστηριότητα, όπου λειτουργεί για να αναπαραγάγει το DNA όταν διαιρούν τα κύτταρα (10.11).  Μόνο πρόσφατα έχει τους επιστήμονες έμαθε να χειρίζεται αυτήν την δραστηριότητα και να την εφαρμόζει στην επιστημονική έρευνα.  Τα πιό πρόωρα pcr πειράματα το τεμάχιο Klenow της πολυμεράσης Ι DNA Escherichia coli σε μια θερμοκρασία 37C για να ενισχύσουν τους συγκεκριμένους στόχους από το ανθρώπινο genomic DNA (5.6).  Συχνά αυτές οι pcr αντιδράσεις παρήγαγαν ημιτελώς το καθαρό προϊόν στόχων όπως κρίνεται από την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων (1).  Αυτές οι αρχικές pcr ενισχύσεις με το τεμάχιο Klenow δεν ήταν ιδιαίτερα συγκεκριμένες (5.6).  Αν και ένα μοναδικό τεμάχιο DNA θα μπορούσε να είναι ενισχυμένες πτυχές ~200,000 από το genomic DNA, μόνο περίπου 1% του pcr προϊόντος ήταν η στοχοθετημένη ακολουθία (13).  Ένας συγκεκριμένος έλεγχος υβριδοποίησης απαιτήθηκε για να αναλύσει το ενισχυμένο DNA (5.6).  
Μερικοί pcr όροι καθορίστηκαν για να αυξήσουν την αυστηρότητα της υβριδοποίησης εγχυτήρων όπως οι χαμηλότερες συγκεντρώσεις MgCl2 και οι υψηλότερες ανοπτώντας θερμοκρασίες.
Επιπλέον, η συγκέντρωση του ενζύμου και των εγχυτήρων, ο ανοπτώντας χρόνος, χρόνος επέκτασης, και αριθμός pcr οι κύκλοι όλοι βρέθηκαν για να επηρεάζουν την ιδιομορφία pcr.
Επίσης, η συγκέντρωση μιας συγκεκριμένης ακολουθίας σε ένα δείγμα μπορεί επίσης να επηρεάσει τη σχετική ομοιογένεια των pcr προϊόντων (1.7.13.14.15).   Τα τριφωσφορικά άλατα και το μαγνήσιο Deoxyribonucleotide σε έναν κατάλληλο προσωρινό χώρο είναι επίσης σημαντικά συστατικά για pcr.  Η αποδοτικότητα και η ιδιομορφία PCRs μπορούν να επηρεαστούν από τις παραλλαγές στη συγκέντρωση και την αναλογία του ελεύθερου μαγνήσιου, των τριφωσφορικών αλάτων deoxyribonucleotide, και των εγχυτήρων.  Αυτά τα αντιδραστήρια πρέπει να βελτιστοποιηθούν προκειμένου να επιτευχθούν η υψηλές ιδιομορφία και η παραγωγή (14).  Επίσης ανακαλύφθηκε ότι η επίδραση της θερμοκρασίας και oligonucleotide του μήκους εγχυτήρων στην ιδιομορφία και αποδοτικότητα της ενίσχυσης από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων (15).
Η αδρανοποίηση του τεμαχίου Klenow της πολυμεράσης Ι DNA Escherichia coli στην υψηλή θερμοκρασία που απαιτήθηκε για το χωρισμό σκελών απαίτησε την προσθήκη του ενζύμου μετά από το βήμα αλλοίωσης κάθε κύκλου (5.6).  Πριν από το 1988, καθένας που διευθύνει μια pcr διαδικασία αντίδρασης υποχρεώθηκε για να καθίσει υπομονετικά από μια σειρά λουτρών ύδατος ή ομάδων δεδομένων θέρμανσης και να προσθέσει ένα φρέσκο υποπολλαπλάσιο της πολυμεράσης DNAE.Coli μετά από κάθε βήμα αλλοίωσης, το οποίο πραγματοποιήθηκε χαρακτηριστικά με τη βύθιση του σκάφους αντίδρασης στο βράζοντας ύδωρ για ½ ένα λεπτό σε 3 λεπτά (7).   Αυτό το μάλλον κουραστικό βήμα αποβλήθηκε από την εισαγωγή μιας thermostable πολυμεράσης DNA, η πολυμεράση DNATaq(12) μιά φορά, στην αρχή της pcr αντίδρασης.  Οι thermostable ιδιότητες της δραστηριότητας πολυμεράσεων DNA απομονώθηκαν από το aquaticus Thermus (Taq) (το σχήμα 4) που αυξάνονται geysers άνω των 110C, και έχει συμβάλει πολύ στην παραγωγή, την ιδιομορφία, την αυτοματοποίηση, και το βοήθημα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσεων (1.7.12).   Το ένζυμο Taq μπορεί να αντισταθεί τη συνεχή θέρμανση σε 94C και έτσι κάθε φορά που δροσίζεται το μίγμα για να επιτρέψει στους oligonucleotide εγχυτήρες για να δεσμεύσει τον καταλύτη για την επέκταση είναι ήδη παρών (1.7).  Εντούτοις, οι υψηλότερες ανοπτώντας θερμοκρασίες δεν καθιερώθηκαν μέχρι την ενιαία “σημαντικότερη ανάπτυξη pcr της ανάπτυξης” (8), του καθαρισμού και της εμπορικής διανομής μιας ανθεκτικής στη θερμότητα πολυμεράσης DNA από το thermophilicaquaticus Thermus βακτηριδίων (Taq) (12). 
Η απομόνωση μιας ανθεκτικής στη θερμότητα πολυμεράσης DNA επέτρεψε επίσης στην ανόπτηση και την επέκταση εγχυτήρων για να πραγματοποιηθεί στις ανυψωμένες θερμοκρασίες (1.7.12.13), με αυτόν τον τρόπο τη μείωση της συνδυασμένης κακώς ανόπτησης στις ακολουθίες nontarget (μη συγκεκριμένη ενίσχυση) ή την αύξηση της ιδιομορφίας.   Κατ' αυτό τον τρόπο, για πολλές ενισχύσεις το pcr προϊόν θα μπορούσε να ανιχνευθεί ως ενιαία βρωμίδιο-λεκιασμένη ethidium ζώνη σε ένα ηλεκτροφορητικό πήκτωμα (12).  Αυτή η αυξανόμενη ιδιομορφία αύξησε επίσης την παραγωγή DNA της ακολουθίας στόχων.  Επιπλέον, τα μακρύτερα pcr προϊόντα θα μπορούσαν να ενισχυθούν από το genomic DNA, πιθανώς που οφείλεται σε μια μείωση της δευτεροβάθμιας δομής των σκελών προτύπων στην ανυψωμένη θερμοκρασία που χρησιμοποιήθηκε για την επέκταση εγχυτήρων.  Το ανώτερο όριο μεγέθους για την ενίσχυση πολυμεράσεων τεμαχίων Klenow ήταν μόνο για 400bp.  Η πολυμεράση Taq και άλλες thermostable πολυμεράσεις έχουν συνθέσει τα τεμάχια μέχρι 10 KB (1.7.12.13).  Η διαθεσιμότητα της πολυμεράσησ Taq επίσης πολύ έχει απλοποιήσει την αυτοματοποίηση της αντίδρασης δεδομένου ότι είναι μια πολύ ευκολότερη στοιχειώδης εργασία να κατασκευαστεί μια συσκευή που θα ανακυκλώσει έναν σωλήνα αντίδρασης μέσω των διαφορετικών θερμοκρασιών από για να κατασκευάσει μια συσκευή που θα εκτελούσε και και την προσθήκη των ενζυμικών υποπολλαπλάσιων.  Αυτήν την περίοδο υπάρχει μια μεγάλη ποικιλία των thermocyclers διαθέσιμων εμπορικά.  Αυτή η ανάπτυξη είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη γρήγορη εφαρμογή αυτής της τεχνολογίας από την επιστημονική κοινότητα (7). 

Βοήθημα pcr

            Εκτός από την παραγωγή των double-stranded, αμβλύς-τελειωμένων τεμαχίων DNA που μπορούν να διαμορφωθούν από pcr, δύο άλλα χαρακτηριστικά γνωρίσματα του pcr σχεδίου συμβάλλουν πολύ στο βοήθημα pcr.  Κατ' αρχάς, η θέση του συσχετισμού των εγχυτήρων καθορίζει τα όρια του ενισχυμένου τεμαχίου και επομένως η προγενέστερη μοριακή απαίτηση κλωνοποίησης των περιοχών αναγνώρισης ενδονουκλεάσεων περιορισμού δεν απαιτείται για pcr.  Δεδομένου ότι μόνο ένας περιορισμένος αριθμός ακολουθιών DNA είναι περιοχές περιορισμού, pcr αυξάνει πολύ την ευελιξία της επιλογής του μεγέθους και της σύνθεσης τεμαχίων.  Αφετέρου, δεν είναι απαραίτητο για pcr oligonucleotides να συμπληρώσουν ακριβώς το DNA προτύπων.  “Οι ουρές” μπορούν να προστεθούν στο τέλος’ 5 του εγχυτήρα για να εισαγάγουν τις ακολουθίες μέσα στις περιοχές εμπυρεύματος που μπορούν έτσι να χρησιμοποιηθούν για να εισαγάγουν τις περιοχές αναγνώρισης ενδονουκλεάσεων περιορισμού ή άλλες χρήσιμες ακολουθίες όπως οι μεταλλαγές στο ενισχυμένο DNA.  Αυτά τα φαινόμενα επέτρεψαν την εμφάνιση pcr ως μέθοδο για τη γρήγορη κλωνοποίηση DNA (1.7.13).

Pcr και μοριακή κλωνοποίηση

Η μοριακή κλωνοποίηση έχει ωφεληθεί από την εμφάνιση pcr ως τεχνική.  Η άμεση κλωνοποίηση διευθύνθηκε αρχικά χρησιμοποιώντας ένα τεμάχιο DNA σημείου ζέσεως 110 που ενισχύθηκε από pcr και oligonucleotide τους εγχυτήρες που περιείχαν τις περιοχές αναγνώρισης ενδονουκλεάσεων περιορισμού που προστέθηκαν σε 5 άκρες’ τους.  Αυτές οι περιοχές χρησιμοποιήθηκαν για να διευκολύνουν την κλωνοποίηση του ενισχυμένου DNA σε ένα M13 πλασμίδιο (17).  Το τεμάχιο σημείου ζέσεως 110 τοποθετήθηκε διαδοχικά επίσης για να επιβεβαιώσει ότι αυτή η προσέγγιση ήταν μια γρήγορη όμως αξιόπιστη προσέγγιση στην κλωνοποίηση.  (Σχήμα 5)

Misincorporation: Σφάλματα των in vitro συστημάτων

Η κύτταρο-βασισμένη κλωνοποίηση DNA περιλαμβάνει την αντένσταση DNA in vivo, η οποία συνδέεται με μια πολύ υψηλή πίστη της αντιγραφής λόγω των μηχανισμών διόρθωσης δοκιμίων.  Εντούτοις, όταν ξαναδιπλώνεται in vitro το DNA όπως με pcr, το ποσοστό σφάλματος αντιγραφής είναι αρκετά μεγαλύτερο.  Η ευρύτατα χρησιμοποιημένη πολυμεράση, πολυμεράση DNATaq εντούτοις, δεν έχει κανένα σχετικό exonuclease’3 έως’ 5 για να παρέχει μια λειτουργία διόρθωσης δοκιμίων.  Κατά συνέπεια το ποσοστό σφάλματος λόγω για να βασίσει το misincorporation κατά τη διάρκεια της αντένστασης DNA είναι μάλλον υψηλό για Taq: για μια ακολουθία 1 KB που έχει υποβληθεί σε 20 αποτελεσματικούς κύκλους του διπλασιασμού, περίπου 40% των νέων σκελών DNA που συντίθενται από pcr που χρησιμοποιεί αυτό το ένζυμο περιέχει μια ανακριβή νουκλεοτίδα ως αποτέλεσμα ενός σφάλματος αντιγραφής (16).  Επομένως, ακόμα κι αν η pcr αντίδραση περιλαμβάνει την ενίσχυση μιας ενιαίας ακολουθίας DNA, το τελικό προϊόν θα είναι ένα μίγμα σχεδόν να ταιριάξει με, αλλά μη ίδιες ακολουθίες DNA.  Παρά τα σφάλματα λόγω στην αντένσταση in vitro, η αλληλοuχία DNA του συνολικού pcr προϊόντος μπορεί να δώσει τη σωστή ακολουθία λόγω στο γεγονός ότι η ενσωμάτωση των ανακριβών βάσεων είναι ουσιαστικά τυχαία και η συμβολή μιας ανακριβούς βάσης σε ένα ή περισσότερα σκέλη συντρίβεται από τις συνεισφορές από την τεράστια πλειοψηφία των σκελών που θα έχει τη σωστή ακολουθία.  Εντούτοις, εάν το pcr προϊόν πρόκειται να κλωνοποιηθεί στα κύτταρα, διάφοροι μεμονωμένοι κλώνοι μπορεί να πρέπει να τοποθετηθούν διαδοχικά προκειμένου να καθοριστεί η σωστή ακολουθία (συναίνεσης), πριν από να πραγματοποιήσουν τα περαιτέρω πειράματα.
Πιό πρόσφατα, το πρόβλημα της απιστίας της αντένστασης DNA κατά τη διάρκεια της pcr αντίδρασης έχει περιοριστεί αρκετά με τη χρησιμοποίηση των εναλλακτικών heat-stable πολυμεράσεων DNA που έχουν συνδέσει τη δραστηριότητα’ exonuclease 3’ έως 5.  Οι πολυμεράσεις και ThermococcusLitoralisDNAfuriosus Pyrococcus ( Pfu) (ΔΙΈΞΟΔΟΣ) γίνονται ευρύτερα χρησιμοποιημένες λόγω της διόρθωσης δοκιμίων που παρέχεται από τη δραστηριότητα του σχετικού exonuclease’ 3 έως’ 5 τους (18).  Το προκύπτον pcr προϊόν Pfu παραδείγματος χάριν, έχει ένα πολύ χαμηλότερο επίπεδο μεταλλαγών που εισάγονται με την αντιγραφή των σφαλμάτων: για ένα τμήμα μνήμης 1 KB του DNA που έχει υποβληθεί σε 20 αποτελεσματικούς κύκλους του διπλασιασμού, περίπου 3,5% του DNA προσαράσσει στο προϊόν φέρνει μια αλλαγμένη βάση (16).

Ιδιομορφία αντίδρασης

Οι νέες προσεγγίσεις για να βελτιώσουν την ιδιομορφία έχουν αναπτυχθεί βασισμένος στην αναγνώριση ότι η πολυμεράση DNA Taq διατηρεί την ιδιαίτερη ενζυματική δραστηριότητα στις θερμοκρασίες αρκετά κάτω από το βέλτιστο για τη σύνθεση DNA.  Κατά συνέπεια, οι εγχυτήρες που ανοπτούν μη-συγκεκριμένα σε μια μερικώς ενιαία προσαραγμένη περιοχή προτύπων μπορούν να επεκταθούν προτού να φθάσει η αντίδραση σε 72°C για την επέκταση των συγκεκριμένα ανοπτημένων εγχυτήρων.  Εάν η πολυμεράση DNA ενεργοποιείται μόνο αφού έχει φθάσει η αντίδραση στις υψηλές (> 70°C) θερμοκρασίες, η ενίσχυση μη-στόχων μπορεί να ελαχιστοποιηθεί (19.20).  Αυτή η “καυτή προσέγγιση” έναρξης μπορεί να ολοκληρωθεί από τη χειρωνακτική προσθήκη ενός ουσιαστικού αντιδραστηρίου στο σωλήνα επιλογής στις ανυψωμένες θερμοκρασίες.  Η προσθήκη της δεσμευτικής πρωτεϊ'νης ssDNA έχει αναφερθεί επίσης στη συγκεκριμένη ενίσχυση αύξησης.  Μια φιλικότερη προς το χρήστη προσέγγιση είναι να χρησιμοποιηθεί είτε η παρεμπόδιση είτε η αδρανοποίηση η ίδια της πολυμεράσης DNA.  Δύο τύποι παρεμποδίσεων της πολυμεράσης DNA Taq έχουν δοκιμαστεί συμπεριλαμβανομένης oligonucleotide της παρεμπόδισης (21) και της παρεμπόδισης αντισωμάτων (22). Οι ιδιαίτερα συγκεκριμένοι oligonucleotide ανασταλτικοί παράγοντες και των δύο πολυμεράσεων DNA Taq έχουν παραχθεί.  Αυτοί εμποδίζουν επιλεκτικά τη δραστηριότητα πολυμεράσεων DNA στις θερμοκρασίες κάτω από 40°C και έχουν αποδειχθεί για να λειτουργήσουν στις καυτές εφαρμογές έναρξης.  Εναλλακτικά, κάποιος μπορεί να χρησιμοποιήσει ένα αντίσωμα ενάντια στην πολυμεράση DNA Taq. Το αντίσωμα εμποδίζει την πολυμεράση DNA έως ότου η θερμοκρασία pcr είναι τέτοια που το αντίσωμα μετουσιώνεται σε μια θερμοκρασία μεγαλύτερη από 55°C, με αυτόν τον τρόπο εκδίδοντας το ένζυμο.  Εντούτοις υπάρχουν μειονεκτήματα σε αυτόν τον τύπο καυτών όρων έναρξης.  Σε αυτήν την περίπτωση, κάποιος χρειάζεται ένα αντίσωμα για κάθε διαφορετικό ένζυμο που χρησιμοποιείται pcr και για έναν μεγάλο αριθμό του PCRs αυτό μπορεί να αυξηθεί δαπάνες σημαντικά.  Η καταλληλότερη μορφή της καυτής έναρξης είναι να τροποποιηθεί η πολυμεράση DNA κατά τέτοιο τρόπο ώστε είναι ανενεργός στη θερμοκρασία δωματίου (θερμοκρασία-ευαίσθητη μετάλλαξη), και επανενεργοποιείται μόνο μετά από την επώαση σε 95°C για 6-15 λεπτά (23).  

Σημαντικά πλεονεκτήματα pcr ως μέθοδο κλωνοποίησης περιλαμβάνουν την ταχύτητα, την ευαισθησία, και την ευρωστία του

Λόγω της απλότητάς του, pcr είναι μια δημοφιλής τεχνική με ένα ευρύ φάσμα των εφαρμογών
συμπεριλαμβανομένης της άμεσης αλληλοuχίας, της genomic κλωνοποίησης, της δακτυλογράφησης DNA, της ανίχνευσης των μολυσματικών μικροοργανισμών, της περιοχή-κατευθυνμένης μεταλλαξιγένεσης, της προγενέθλιας γενετικής έρευνας ασθενειών, και της ανάλυσης των αλληλόμορφων παραλλαγών ακολουθίας (1.7.13.16) που εξαρτώνται από ουσιαστικά τρία σημαντικά πλεονεκτήματα της μεθόδου:

Ταχύτητα και ευκολία της χρήσης:   Η κλωνοποίηση DNA από pcr μπορεί να εκτελεσθεί σε ένα σχετικά σύντομο χρονικό διάστημα, μέσα σε μερικές ώρες.  Συνήθως, μια pcr αντίδραση αποτελείται από περίπου 30 κύκλους κάθε κύκλος που περιέχει μια αλλοίωση, σύνθεση και poy το βήμα, με έναν μεμονωμένο κύκλο που παίρνει χαρακτηριστικά 35 λ. σε ένα αυτοματοποιημένο θερμικό cycler.  Αυτό είναι σαφώς γρηγορότερο από το χρόνο που απαιτείται για την κύτταρο-βασισμένη κλωνοποίηση DNA, η οποία θα μπορούσε να πάρει τις εβδομάδες του χρόνου.  Επιπλέον, είναι αρκετά εύκολο στην οργάνωση μια pcr αντίδραση και η χρήση μιας μηχανής thermocycler είναι επίσης εύκολη.  Κάποιος χρόνος απαιτείται για το σχέδιο και τη σύνθεση oligonucleotide των εγχυτήρων, αλλά αυτό έχει απλοποιηθεί από τη διαθεσιμότητα του λογισμικού υπολογιστών για το σχέδιο εγχυτήρων και τη γρήγορη εμπορική ή ακαδημαϊκή σύνθεση oligonucleotides συνήθειας.   Η βελτιστοποίηση pcr των όρων μπορεί να απαιτηθεί όπως η ανοπτώντας θερμοκρασία εγχυτήρων, η συγκέντρωση μαγνήσιου, και η συγκέντρωση εγχυτήρων.  Εντούτοις, η δημιουργία pcr κλίσης των μηχανών που επιτρέπουν σε ποικίλες ανοπτώντας θερμοκρασίες εγχυτήρων για να εξεταστούν συγχρόνως έχει μειώσει πολύ το χρόνο που απαιτείται για αυτό το βήμα.  Μόλις ληφθούν οι βέλτιστοι όροι για μια αντίδραση, η αντίδραση μπορεί έπειτα να επαναληφθεί απλά (1.7.13.16). 

Ευαισθησία:  Pcr είναι σε θέση τις ακολουθίες από τα μικρά ποσά του DNA στόχων, ακόμη και το DNA από μονοκύτταρο (24).  Τέτοια έξοχη ευαισθησία έχει αντέξει οικονομικά τις νέες μεθόδους τη μοριακή παθογένεση και έχει βρεί τις πολυάριθμες εφαρμογές στη δικανική επιστήμη, στη διάγνωση, στη γενετική ανάλυση συνδέσμων χρησιμοποιώντας τη δακτυλογράφηση ενιαίος-σπέρματος και στις μοριακές μελέτες παλαιοντολογίας, όπου τα δείγματα μπορούν να περιέχουν τους μικρούς αριθμούς κυττάρων. Εντούτοις, η ακραία ευαισθησία της μεθόδου σημαίνει ότι η μεγάλη προσοχή πρέπει να ληφθεί για να αποφύγει τη μόλυνση του δείγματος υπό έρευνα από το εξωτερικό DNA, όπως από τα μικρά ποσά κυττάρων από το χειριστή (1.7.13.16).

Ευρωστία:  Μια ευρεία σειρά των πηγών νουκλεϊνικού οξέος είναι κατάλληλα πρότυπα για pcr την ενίσχυση.  Καθαρισμένα DNAs από τα διάφορα είδη και τις πηγές έχουν ενισχυθεί.  Pcr μπορεί να επιτρέψει την ενίσχυση των συγκεκριμένων ακολουθιών από το υλικό στο οποίο το DNA υποβιβάζεται άσχημα ή ενσωματώνεται σε ένα μέσο από το οποίο η συμβατική απομόνωση DNA είναι προβληματική. Κατά συνέπεια, είναι πάλι πολύ κατάλληλο για τις μοριακές μελέτες ανθρωπολογίας και παλαιοντολογίας, παραδείγματος χάριν η ανάλυση του DNA που ανακτάται από τα αρχαιολογικά υπολείμματα. Έχει χρησιμοποιηθεί επίσης επιτυχώς για να ενισχύσει το DNA από τα φορμαλην-σταθερά ή παραφίνη-ενσωματωμένα δείγματα ιστού, το οποίο έχει τις σημαντικές εφαρμογές στη μοριακή παθολογία και, σε μερικές περιπτώσεις, τις γενετικές μελέτες συνδέσμων.  Γενικά, η επιτυχία pcr της ενίσχυσης είναι μέγιστη όταν τα τεμάχια στόχων είναι σχετικά άφθονα (1.7.13.16). 

Περιορισμοί pcr

Παρά την τεράστια δημοτικότητά του, pcr έχει ορισμένους περιορισμούς ως μέθοδο για ακολουθίες DNA επιλεκτικά κλωνοποίησης τις συγκεκριμένες. 
Προκειμένου να κατασκευαστούν οι συγκεκριμένοι oligonucleotide εγχυτήρες που επιτρέπουν την εκλεκτική ενίσχυση μιας ιδιαίτερης ακολουθίας DNA, κάποιες προγενέστερες πληροφορίες ακολουθίας είναι συνήθως απαραίτητες.  Αυτό κανονικά σημαίνει ότι η περιοχή DNA ενδιαφέροντος έχει χαρακτηριστεί εν μέρει προηγουμένως, συχνά μετά από την προγενέστερη κύτταρο-βασισμένη κλωνοποίηση DNA.  Εντούτοις, ποικίλες προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί που μειώνουν ή ακόμα και αποκλείουν την ανάγκη για τις προγενέστερες πληροφορίες ακολουθίας DNA σχετικά με το DNA στόχων.  Οι προηγουμένως uncharacterized ακολουθίες DNA μπορούν μερικές φορές να κλωνοποιηθούν χρησιμοποιώντας pcr με εκφυλισμένα oligonucleotides εάν είναι μέλη ενός γονιδίου ή επαναλαμβανόμενη οικογένεια DNA τουλάχιστον μια των της οποίας μελών έχει χαρακτηριστεί προηγουμένως.   Σε μερικές περιπτώσεις, pcr μπορεί να χρησιμοποιηθεί αποτελεσματικά χωρίς οποιεσδήποτε προγενέστερες πληροφορίες ακολουθίας σχετικά με το DNA στόχων για να επιτρέψει το indiscriminateamplification των ακολουθιών DNA από μια πηγή του DNA που είναι παρούσα σε extemely περιορισμένες ποσότητες.  Επομένως, αν και pcr μπορεί να εφαρμοστεί για να εξασφαλίσει ολόκληρη ενίσχυση γονιδιώματος, δεν έχει το πλεονέκτημα της κύτταρο-βασισμένης κλωνοποίησης DNA στην προσφορά ενός τρόπου τους μεμονωμένους κλώνους DNA περιλαμβάνοντας μια genomic βιβλιοθήκη DNA.
Το ποσό pcr προϊόντος που λαμβάνεται σε μια ενιαία αντίδραση είναι επίσης περιορισμένο από το ποσό που μπορεί να είναι αποκτηθείσα χρησιμοποίηση κύτταρο-που βασίζεται κλωνοποιώντας όπου κλίμακα-επάνω των εντάσεων του ήχου των κυτταροκαλλιεργειών είναι δυνατός. Η αποδοτικότητα μιας pcr αντίδρασης θα ποικίλει από το πρότυπο στο πρότυπο και σύμφωνα με τους διάφορους παράγοντες που απαιτούνται για να βελτιστοποιήσουν την αντίδραση αλλά χαρακτηριστικά μόνο τα συγκριτικά μικρά ποσά προϊόντος επιτυγχάνονται.
Αν και η θεωρητική παραγωγή pcr είναι εκθετική, η πραγματική παραγωγή pcr είναι πολύ λιγότερο δείχνοντας ότι το σχέδιο λειτουργεί με λιγότερο από τη μέγιστη δυνατότητά του.  Παραδείγματος χάριν, το ποσό προϊόντος σε επίπεδα κάθε κύκλων τελικά μακριά.  Αυτό το οροπέδιο μπορεί να εξηγηθεί από τα ακόλουθα φαινόμενα.  Κατ' αρχάς, μερικά από το πρότυπο δεν μπορούν ποτέ να είναι διαθέσιμα οφειλόμενα στα σπασίματα σκελών ή αποτυχία του DNA χωρισμένος από άλλα μακρομόρια κατά τη διάρκεια του καθαρισμού και των αρχικών thermocycles.  Αφετέρου, το ποσό ενζύμου είναι πεπερασμένο και τελικά η δραστηριότητα μπορεί να μειωθεί.  Τρίτον, καθώς η συγκέντρωση του double-stranded προϊόντος φθάνει στα υψηλά επίπεδα, αυξήσεις ανταγωνισμού μεταξύ της ανόπτησης του προτύπου (pcr προϊόν) στον εγχυτήρα και των συμπληρωματικών σκελών προτύπων (1.7.13).
Ένας προφανής και πολλές χρονικό μεγάλο μειονέκτημα pcr ως μέθοδο κλωνοποίησης DNA είναι η σειρά μεγέθους των ακολουθιών DNA που μπορούν να κλωνοποιηθούν.  Αντίθετα από το κύτταρο-βασισμένο DNA που κλωνοποιεί όπου το μέγεθος των κλωνοποιημένων ακολουθιών DNA μπορεί να πλησιάσει 2 ΜΒ, οι αναφερόμενες ακολουθίες DNA που κλωνοποιούνται από pcr ήταν χαρακτηριστικά στη 0,1σειρά μεγέθους 5 KB, συχνά στο χαμηλότερο όριο αυτής της κλίμακας.  Τα μικρά τεμάχια του DNA μπορούν συνήθως να ενισχυθούν εύκολα από pcr, εντούτοις γίνεται όλο και περισσότερο δυσκολότερο να ληφθεί η αποδοτική ενίσχυση καθώς το επιθυμητό μήκος προϊόντων αυξάνεται.  Το Barnes (25) αναγνώρισε έναν περιορισμό μήκους στόχων pcr στην ενίσχυση του DNA.  Χρησιμοποίησε έναν συνδυασμό ενός υψηλού επιπέδου μιας εξονuθλεασε-ελεύθερης, ν-τελικής μετάλλαξης διαγραφής της πολυμεράσης DNA Taq, Klentaq1, με ένα πολύ χαμηλό επίπεδο μιας thermostable πολυμεράσης DNA εκθέτοντας μια δραστηριότητα 3'-exonuclease (Pfu, διέξοδος, ή βαθιά διέξοδος) για να διευθύνει υψηλό μακροχρόνιο pcr πίστης. Τουλάχιστον 35 KB του βακτηριοφάγου λάμδα μπορούν να ενισχυθούν στις υψηλές παραγωγές από 1 NG του προτύπου DNA λάμδα.  Η χρήση αυτής της μεθόδου παρήγαγε την αυξανόμενη πίστη βάση-ζευγαριού, τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθούν pcr τα προϊόντα ως εγχυτήρες, και τη μέγιστη παραγωγή του τεμαχίου στόχων.  Αλλοι όροι έχουν προσδιοριστεί για την αποτελεσματική ενίσχυση των πιό μακροχρόνιων στόχων, συμπεριλαμβανομένης της ενίσχυσης μέχρι 22 KB του τομέα γονιδίων βήτα-γλοψην από το ανθρώπινο genomic DNA και μέχρι 42 KB από το DNA phaga λάμδα (26).  Οι όροι για αυτά τα μακριά PCRs περιέλαβαν το αυξανόμενο pH, την προσθήκη της γλυκερίνης και διμεθυλικό sulfoxide, τους μειωμένους χρόνους αλλοίωσης, τους αυξανόμενους χρόνους επέκτασης, και τη χρήση μιας δευτεροβάθμιας thermostable πολυμεράσης DNA που κατέχει το α 3'- σε 5'-exonuclease, ή "τη διόρθωση δοκιμίων," δραστηριότητα.  Το "μακροχρόνιο pcr" πρωτόκολλο διατήρησε την ιδιομορφία που απαιτήθηκε για τους στόχους στο genomic DNA με τη χρησιμοποίηση των χαμηλότερων επιπέδων πολυμεράσης και της θερμοκρασίας και των αλατισμένων όρων για τη συγκεκριμένη ανόπτηση εγχυτήρων.  Η δυνατότητα να ενισχυθούν οι ακολουθίες DNA 10-40 KB θα φέρει την ταχύτητα και την απλότητα pcr στην genomic χαρτογράφηση και την αλληλοuχία και θα διευκολύνει τις μελέτες στη μοριακή γενετική (26).  Γενικά, οι όροι για pcr μακροχρόνιας σειράς περιλαμβάνουν έναν συνδυασμό τροποποιήσεων στους πρότυπους όρους με ένα σύστημα δύο-πολυμεράσεων.  Αυτό παρέχει τα βέλτιστα επίπεδα δραστηριότητας πολυμεράσεων DNA και’exonuclease 3’ έως 5 που χρησιμεύει ως ένας μηχανισμός διόρθωσης δοκιμίων (16).

Όργανα για pcr

Το Thermocyclers που ρυθμίζουν αυτόματα τις θερμοκρασίες για pcr ανακυκλώνοντας εισήχθη το 1986 (σχήμα 6).  Εκτός από τις προόδους pcr στα αντιδραστήρια, τα νέα όργανα για την αυτοματοποιημένη θερμική ανακύκλωση και για την ανάλυση pcr των προϊόντων έχουν αναπτυχθεί.  Τα νέα θερμικά cyclers έχουν αυξήσει τα ποσοστά, και μεταφοράς θερμότητας στα τροποποιημένα σκάφη αντίδρασης.  Τα σκάφη αντίδρασης που προσαρμόστηκαν από τα θερμικά cyclers πρώτης γενεάς (ή ακόμα και τα λουτρά ύδατος και τις ομάδες δεδομένων θέρμανσης) ήταν πρότυποι πλαστικοί σωλήνες microfuge.  Pcr η ενίσχυση στους λεπτούς τριχοειδείς σωλήνες επέτρεψε τη γρήγορη θερμική ανακύκλωση, και τη σύνθεση DNA στη δεκαετία του '20.  Η ταχύτητα των αλλαγών θερμοκρασίας που επιτυγχάνονται σε αυτά τα συστήματα έχει επιτρέψει τον ακριβή καθορισμό των βέλτιστων θερμοκρασίας για κάθε μεμονωμένο βήμα στο pcr κύκλο.   Τα θερμικά cyclers νέας γενεάς προσαρμόζουν επίσης περισσότερα δείγματα, έχουν τα ακριβέστερα θερμικά σχεδιαγράμματα, και είναι προγραμματίσημο (13). 

Oligonucleotide σύνθεση

Μια από τις λιγότερες εκτιμημένες συνεισφορές στη διαδεδομένη εφαρμογή pcr είναι η ανάπτυξη της αξιόπιστης αυτοματοποιημένης χημείας για oligonucleotide τη σύνθεση.  Μέχρι σήμερα, η κατασκευή ενιαίο oligonucleotide ήταν μια ουσιαστική στοιχειώδης εργασία που θα μπορούσε μόνο να εκτελεσθεί από έναν ειδικευμένο οργανικό φαρμακοποιό.  Τώρα είναι δυνατό να αγοραστεί είτε ένας oligonucleotide συνθέτης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί από έναν τεχνικό ή oligonucleotides οι ίδιοι από μια εμπορική ή ακαδημαϊκή πηγή.  Οι πολλαπλές oligonucleotide μηχανές σύνθεσης έχουν κατασκευαστεί με το στόχο το γενικό κόστος της σύνθεσης (27.28).  Δεδομένου ότι oligonucleotides καθορίζουν τα ενδεχόμενα pcr προϊόντα, δεν υπάρχει αμφιβολία ότι ελλείψει του τους αναμείνετε τον ανεφοδιασμό, pcr δεν θα είχε απολαύσει την ευρεία αποδοχή ότι έχει κερδίσει σήμερα (13). 

Σχέδιο εγχυτήρων

Οι ερευνητές συμφώνησαν ότι αρχικά αυτόν το σχέδιο pcr των εγχυτήρων ήταν δύσκολο και αναξιόπιστο.  Τα προγράμματα υπολογιστών επινοήθηκαν για να λάβουν όλα τα κριτήρια σχεδίου λογαριάζουν υπόψη.   Ένα από τα πρώτα προγράμματα που γράφτηκαν για το σχέδιο εγχυτήρων ήταν η Όλγα που χρησιμοποίησε την εφαρμογή του ψηφιακού ερευνητικού ΠΟΛΥΤΙΜΟΥ ΛΊΘΟΥ (διευθυντής περιβάλλοντος γραφικής παράστασης) στο Atari ST (29).  Την Όλγα ταιρίαξαν συγκεκριμένα στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων (pcr) που επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση δύο ακολουθιών εγχυτήρων.  Το πλεονέκτημα της Όλγα ήταν ότι επέτρεψε στις αναλύσεις ενός προγράμματος τις άμεσες επαναλήψεις, δευτεροβάθμιο dimerization δομών και εγχυτήρων καθώς επίσης και διάφορα χρήσιμα εργαλεία "λήξησ" για τους εργαζομένους που συμμετέχθηκαν pcr στη βελτιστοποίηση και oligonucleotide τις συνθέσεις.   Το πρόγραμμα Primer3 στο ίδρυμα Whitehead είναι τώρα πιθανά το πιό αξιόπιστο και ευπροσάρμοστο εργαλείο διαθέσιμο σήμερα (30).

Pcr σήμερα

Τα PCRs μπορούν τώρα να εκτελεσθούν επιτρέποντας την ενίσχυση των τεμαχίων DNA μέχρι διάφορες κιλοβάσεις στο μήκος από περισσότερους του ενός εκατομμύρισσες φορές η αρχική αφθονία τους.  Η διαδικασία είναι ιδιαίτερα automatable και απαιτεί ακριβώς μερικές ώρες από την αρχή στην ανάλυση προϊόντων.  Αυτό δεν ήταν η περίπτωση προηγουμένως, και οι πρακτικές απαιτήσεις για pcr έχουν απλοποιηθεί πολύ από τα πρώτα χειρόγραφα της μεθόδου (13).  Σήμερα, τα περισσότερα από τα αρχικά εμπόδια ή οι ανεπάρκειες pcr έχουν επιλυθεί (8).   Επιπλέον, pcr έχει επεκταθεί για να περιλάβει περισσότερα από 270.000 άρθρα (31).

Pcr θα αντικατασταθεί πάντα; – Χεληθασε-εξαρτώμενη ενίσχυση (HDA)

  Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων είναι η ευρύτατα χρησιμοποιημένη μέθοδος για την in vitro ενίσχυση DNA εντούτοις απαιτεί τη θερμική αλλοίωση ή για να χωρίσει τα δύο σκέλη DNA.  Θ*ην vivo, το DNA ξαναδιπλώνεται από τις πολυμεράσεις DNA με τις διάφορες βοηθητικές πρωτεϊ'νες.   Το helicase DNA, βοηθητικές πρωτεϊ'νες DNA πολυμεράσεων ενεργεί στο χωριστό διπλό DNA μέσα στα κύτταρα.  Το Vincent et το Al (32) έχουν επινοήσει μια νέα in vitro ισόθερμη μέθοδο ενίσχυσης DNA με τη μίμηση του in vivo μηχανισμού αντενστάσεων.  Η χεληθασε-εξαρτώμενη ενίσχυση (HDA) χρησιμοποιεί ένα helicase DNA για να παραγάγει τα single-stranded πρότυπα για την υβριδοποίηση εγχυτήρων.  Η επόμενη επέκταση εγχυτήρων καταλύεται έπειτα από μια πολυμεράση DNA.  HDA δεν απαιτεί ένα ακριβό thermocycler και έτσι pcr μπορεί να εκτελεσθεί σχεδόν οπουδήποτε.  Επιπλέον, προσφέρει διάφορα πλεονεκτήματα πέρα από άλλες ισόθερμες μεθόδους ενίσχυσης DNA από την κατοχή ενός απλού σχεδίου αντίδρασης και την ύπαρξη μια αληθινή ισόθερμη αντίδραση που μπορεί να εκτελεσθεί σε μια θερμοκρασία για την ολόκληρη διαδικασία. HDA προσφέρει τη μεγάλη υπόσχεση στην ανάπτυξη των απλών φορητών διαγνωστικών συσκευών DNA που χρησιμοποιούνται στο πεδίο και στη σημείο-$$$-ΠΡΟΣΟΧΉ (32).

Συμπεράσματα

Λέγεται τον απλούστερο και καταλληλότερο τρόπο να καθοριστεί pcr είναι ως τεχνική.  Εντούτοις, μια τέτοια κατηγοριοποίηση αποβάλλει την ιστορία pcr της ανάπτυξης όπως πολλά άτομα κατά τη διάρκεια των ετών συνέβαλαν στις ιδέες πίσω από τη θεωρία pcr και του ακριβούς καθορισμού της τεχνικής.  Η επόμενη απλούστερη απάντηση είναι να ονομαστεί ένα άτομο ως εφευρέτη της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσεων.  Το Karry Mullis απονεμήθηκε το βραβείο Νόμπελ για τη χημεία το 1993 για την ανακάλυψη pcr του.  Εντούτοις, αυτή η ανακάλυψη αμφισβητείται μεταξύ πολλών επιστημόνων, οι οποίοι μπορεί να είχαν συμβάλει στο ξεκλείδωμα αυτού του γρίφου.
Επίσης έχει ειπωθεί ότι pcr δεν υπήρξε έως ότου έγινε στην εργασία σε ένα πειραματικό σύστημα.  Έχοντας αυτό υπόψη, μόνο η σκέψη μιας έννοιας δεν είναι ικανοποιητική μια έννοια πρέπει να έχει τεθεί επιτυχώς σε εφαρμογή (33).      
Αν και υπάρχει αμφιβολία ως προς τον τελευταίο δημιουργό pcr, και αμφιβολία ως προς τη δυνατότητα ότι pcr μπορεί κάπως ή κάποτε να αντικατασταθεί, υπάρχει λίγη αμφιβολία ο αντίκτυπος που pcr έχει δημιουργήσει πέρα από μια σύντομη χρονική έκταση στη μελέτη της μοριακών βιολογίας και της ζωής.

Αναφορές

1.         Arnheim, ν Erlich, χ  Στρατηγική αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσεων. ΕΤΗΣΙΑ ΑΝΑΘΕΩΡΗΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ, ΕΝΤΑΣΕΙΣ 61, XIV+1359P. , 1992, σελ. 131-156.
2.         Appenzeller Τ. Democratizing η ακολουθία DNA, επιστήμη, το 1990 χαλά 2, 247 (4946).
3.         Saiki ρ, Κ. Scharf s Faloona φ Mullis Κ. β Horn Γ. τ Erlich χ. Α. Arnheim Ν., ενζυματική ενίσχυση των genomic ακολουθιών βήτα-γλοψην και της ανάλυσης περιοχών περιορισμού για τη διάγνωση της αναιμίας κυττάρων δρεπανιών, επιστήμη, Δεκεμβρίου, 230(4732):1350-4 του 1985 20.
4.         Νότιος, E.M. (1975) ανίχνευση των συγκεκριμένων ακολουθιών μεταξύ των τεμαχίων DNA που χωρίζονται από την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων. Θ*ι. Μορ. βιολ. 98:503518.
5.         Mullis Κ. β Faloona φ. Α Scharf s Saiki Ρ. Κ Κέρατο γ Erlich χ. Α., συγκεκριμένη ενζυματική ενίσχυση του DNA in vitro: η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων. Κρύαλιμενικάσυμπόσια ανοίξεων για την ποσοτική βιολογία, 1986
6.         Mullis Κ. β Faloona φ. Α. Συγκεκριμένη σύνθεση του DNA in vitro μέσω μιας πολυμεράση-καταλυμένης αλυσιδωτής αντίδρασης. Μέθοδοι στην ενζυμολογία, 1987, 155:33550.                
7.         Gibbs, R.A Ενίσχυση DNA από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων.  Αναλυτική χημεία, 1990, 62:12021214.
8.         Mullis, K.B Η ασυνήθιστη προέλευση της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσεων, επιστημονικός Αμερικανός, Απρίλιος 1990.
9.         Kleppe, KE Khorana,Hg (1971) Θ*ι. Μορ. βιολ. 56, 341-346.
10.       Keir, χ Πολυμεράσεις DNA από τα μαστοφόρα κύτταρα. Biol νουκλεϊνικού οξέος RES μορ. Prog. 1965;4:81-128.
11,       Fansler, BS Ευκαριωτικές πολυμεράσεις DNA: η ένωσή τους με τον πυρήνα και σχέση στην αντένσταση DNA. Περιστροφή Cytol INT. 1974;Suppl 4:363415.
12.       Saiki Ρ. Κ Gelfand Δ. χ Stoffel s Scharf Θ*ς. j Higuchi ρ Horn Γ. τ Mullis Κ. β Erlich εκτάριο. Εγχυτήρας-κατευθυνμένη ενζυματική ενίσχυση του DNA με μια thermostable πολυμεράση DNA. Επιστήμη, του Ιαν., 239(4839):487-91 του 1988 29.
13.       Erlich, χ. Α Gelfand, δ Sninsky, Θ*ι. Θ*ι. Recent Advances στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων, επιστήμη, 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.
14.       Ουίλιαμς, JF Στρατηγικές βελτιστοποίησης για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων. Biotechniques. 1989 Ιούλιος-αuγ;7(7):762-9.
15.       Wu dy, Ugozzoli λ, PAL BK, Qian j, rb Wallace.  Η επίδραση της θερμοκρασίας και oligonucleotide του μήκους εγχυτήρων στην ιδιομορφία και αποδοτικότητα της ενίσχυσης από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσεων.  Biol κυττάρων DNA. 1991 απρ;10(3):233-8.
16.       Strachan, τ Διαβάστε A.P Ανθρώπινη μοριακή γενετική 2. 1999. Θ*Ιοχν Wiley & Sons Inc. κεφάλαιο 6 παράγραφος 1.
17.       Scharf Θ*ς. j Horn Γ. τ Erlich χ. Α. Αμεσες κλωνοποίηση και ανάλυση ακολουθίας των enzymatically ενισχυμένων genomic ακολουθιών. Επιστήμη, SEP, 233(4768):1076-8 του 1986 5.
18.       Cline j, Braman JC, Hogrefe HH Pcr πίστη της πολυμεράσης DNA pfu και άλλων thermostable πολυμεράσεων DNA.  Νουκλεϊνικά οξέα RES. 1996 15;24(18):3546-51 SEP.
19.       Falooea, Φ., Weiss, Θ*ς., Ferre, Φ., Mullis, 6η INT διάσκεψη Κ. 1990. AIDS. Απόσπασμα.
20       Δ’Aquila, R.T., Bechtel, L.J., Videler, J.A, Eron, J.J., Goeczyca, Σελ., Kaplan, J.C. 1991.  Νουκλεϊνικά οξέα RES. 19:3749.
21.       Dang γ, Jayasena SD. Oligonucleotide οι ανασταλτικοί παράγοντες της πολυμεράσης DNA Taq διευκολύνουν την ανίχνευση των χαμηλών στόχων αριθμού αντιγράφων από pcr. Θ*ι μορ. βιολ. 1996 29;264(2):268-78 του Νοεμβρίου.
22.       Θ*Κελλογγ de, Rybalkin Ι, Chen s, Mukhamedova ν, Vlasik τ, Siebert pd, Chenchik Α. TaqStart Antibody: pcr "καυτής έναρξησ" που διευκολύνεται ένα εξουδετερώνοντας μονοκλονικό αντίσωμα που κατευθύνεται από ενάντια στην πολυμεράση DNA Taq. Biotechniques. 1994 ιuν;16(6):1134-7.
23.       Kermekchiev ΜΒ, Tzekov Α, Barnes WM. Οι κρύος-ευαίσθητες μεταλλάξεις της πολυμεράσης DNA Taq παρέχουν μια καυτή έναρξη για pcr. Νουκλεϊνικά οξέα RES 2003 ο Νοέμβριος 1;31(21):6139-47.
24.       Χ. Λι, U.B. Gyllenstein, Χ. Cui, R.K. Saiki, Χ. Ehrlich, και Ν. Arnheim. (1988). Ενίσχυση και ανάλυση των ακολουθιών DNA στο ενιαίο ανθρώπινο σπέρμα και την diploid φύση 335 κυττάρων: 414-417.
25.       Barnes WM. Pcr ενίσχυση μέχρι του DNA 35-KB με την υψηλή πίστη και την υψηλή παραγωγή από τα πρότυπα βακτηριοφάγων λάμδα. Το Proc natl Acad Sci ΗΠΑ Α. το 1994 χαλά 15;91(6):2216-20.
26.       Cheng s, Fockler γ, Barnes WM, Higuchi Ρ. Effective ενίσχυση των μακροχρόνιων στόχων από τα κλωνοποιημένα ένθετα και ανθρώπινο genomic DNA. Proc natl Acad Sci ΗΠΑ Α. 1994 jun 7;91(12):5695-9.
27.       Caruthers mh, Barone ΑΓΓΕΛΊΑ, Beaucage SL, Dodds ο ΔΡ, ψαράς EF, McBride LJ, Matteucci μ, Stabinsky ζ, γεύση JY.  Χημική σύνθεση των deoxyoligonucleotides με τη μέθοδο phosphoramidite.  Μέθοδοι Enzymol. 1987;154:287-313.
28.       Beattie KL, Logsdon NJ, Αντερσον RS, εσπηνοσα-Lara JM, μαλδοναδο-Rodriguez ρ, τεχνολογία σύνθεσης γονιδίων παγετού JD 3$ος: πρόσφατες εξελίξεις και μελλοντικές προοπτικές. Biochem. 1988 Dec;10(6):510-21 Appl Biotechnol.
29.       Γέφυρες CG. Όλγα -- oligonucleotide πρόγραμμα σχεδίου εγχυτήρων για το Atari ST.  Comput Appl Biosci. 1990 απρ;6(2):124-5.
30.       Rozen s, Skaletsky Χ. Primer3 στο WWW για τους γενικούς χρήστες και για τους προγραμματιστές βιολόγων. Μέθοδοι μορ. βιολ. 2000;132:365-86.
31.       Θ*Ωορλδ Wide Web θέσης: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed αναζήτηση: “Pcr”
32.       Vincent μ, Xu Υ, Kong Χ. Helicase-dependent ισόθερμη ενίσχυση DNA. Embo ύφασμα 2004 Aug;5(8):795-800. Epub 2004 09 Ιουλίου.           
33.       Θ*Παuλ Rabinow. Παραγωγή pcr, μια ιστορία της βιοτεχνολογίασ, πανεπιστήμιο του Τύπου του Σικάγου, 1996