Υποδοχή στο μοριακό σταθμό!

Πρέπει να καταχωρήσετε προτού να μπορέσετε να ταχυδρομήσετε στα φόρουμ μας ή να χρησιμοποιήσετε τα προηγμένα χαρακτηριστικά γνωρίσματά μας. Κατάλογος τώρα! Ελεύθερος και γρήγορος του!

Ήδη καταχωρημένος; Αδεια εισόδου τώρα κατωτέρω.

Όνομα χρηστών:

Κωδικός πρόσβασης:

Με θυμηθείτε;

Ήδη καταχωρημένος και ξέχασε τον κωδικό πρόσβασής σας; Χτυπήστε κατωτέρω για να το ανακτήσετε.

Ανακτήστε το χαμένο κωδικό πρόσβασης

Ενώστε τώρα - είναι γρήγορο και ελεύθερο!

Ο μοριακός σταθμός είναι το μεγαλύτερο δίκτυο ερευνητών, επιστημόνων και εραστών επιστήμης οπουδήποτε!

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

Ανασυνδυαζόμενη πρωτεϊνική έκφραση

Μοριακός © σταθμός 2006 πνευματικών δικαιωμάτων

Όταν θέλετε να χαρακτηρίσετε ένα γονίδιο ή μια πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντος, πρέπει πρώτα να μελετήσετε τη λειτουργία της. Σε αυτήν την μοριακή εποχή, που λαμβάνει ένα DNA του γονιδίου ενδιαφέροντός σας δεν είναι δύσκολο.

Για να εκφράσει το DNA ως πρωτεϊ'νη, δηλ. μια ανασυνδυαζόμενη πρωτεϊ'νη, μια μπορεί έπειτα εύκολα να διεξαγάγει τις λειτουργικές μελέτες χρησιμοποιώντας την ανασυνδυαζόμενη καθαρισμένη πρωτεϊ'νη.

Μόλις έχετε μια καθαρισμένη πρωτεϊ'νη μπορείτε να διευθύνετε:

• Πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικά πειράματα αλληλεπίδρασης
• Ενζυμικές κινητικές
• Λειτουργικές μελέτες της πρωτεϊ'νης
• Δομικές μελέτες - συμπεριλαμβανομένης της πρωτεϊνικής κρυστάλλωσης, πρωτεϊνική δομή και NMR.
• Μπορείτε επίσης να χρησιμοποιήσετε την πρωτεϊ'νη για να κάνετε τα αντισώματα για τα περαιτέρω πειράματα.

Υπάρχουν δύο βασικά συστήματα για την έκφραση της ανασυνδυαζόμενης πρωτεϊ'νης. Μόλις πάρετε DNA σας κλωνοποιημένο, πρέπει να αποφασίσετε όπου θέλετε να ενισχύσετε την πρωτεϊ'νη σας. Αυτό θα είναι είτε ένα prokaryotic (βακτηριακός) είτε ευκαριωτικό (συνήθως ζύμη ή μαστοφόρο κύτταρο) σύστημα. Η επιλογή του συστήματός σας θα αποφασίσει ποιο διάνυσμα θα χρειαστείτε για να κλωνοποιήσετε DNA σας δεδομένου ότι υπάρχουν διαφορετικοί υποστηρικτές που λειτουργούν σε E.Coli και άλλοι που λειτουργούν καλύτερα με τη ζύμη ή τα μαστοφόρα συστήματα.

Έτσι που το πρωτεϊνικό σύστημα έκφρασης εσείς θα χρησιμοποιήσει;

 Συστήματα για την πρωτεϊνική έκφραση

Prokaryotic πρωτεϊνικά συστήματα έκφρασης

Τα prokaryotic ανασυνδυαζόμενα πρωτεϊνικά συστήματα έκφρασης έχουν διάφορα πλεονεκτήματα. Αυτοί περιλαμβάνουν την ευκολία του πολιτισμού, και η πολύ ταχεία ανάπτυξη κυττάρων που σημαίνει εσείς δεν θα ειναι απαραίτητο να περιμένει πολύ να πάρει πρωτεϊνική από τα βακτηριακά συστήματα μόλις κλωνοποιήσετε DNA σας. Η έκφραση μπορεί να προκληθεί εύκολα στα βακτηριακά πρωτεϊνικά συστήματα έκφρασης χρησιμοποιώντας IPTG. Επίσης, ο καθαρισμός είναι αρκετά απλός στα prokaryotic συστήματα έκφρασης και υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός εμπορικών εξαρτήσεων διαθέσιμων για την ανασυνδυαζόμενη πρωτεϊνική έκφραση.

Αφ' ετέρου, εάν πρέπει να χρησιμοποιήσετε τις πρωτεϊ'νες σας για τις λειτουργικές ή ενζυματικές μελέτες που τα prokaryotic συστήματα είναι ένα πρόβλημα καθώς οι περισσότερες πρωτεϊ'νες γίνονται αδιάλυτες στους οργανισμούς συνυπολογισμού και είναι πολύ δύσκολο να ανακτηθούν ως λειτουργικές πρωτεϊ'νες. Επιπλέον, οι περισσότεροι εάν δεν προστίθενται όλες οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις από τα βακτηρίδια και επομένως η πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντός σας μπορούν να μην είναι λειτουργικοί. Οι ενζυματικές μελέτες μπορούν έτσι να είναι άκαρπες.

Ευκαριωτικά συστήματα έκφρασης

Τα ευκαριωτικά γονίδια δεν είναι πραγματικά “στο σπίτι” στα prokaryotic κύτταρα, ακόμα και όταν εκφράζονται υπό έλεγχο των prokaryotic διανυσμάτων.  Ένας λόγος είναι ότι τα κύτταρα Ε. COLI αναγνωρίζουν συχνά τα πρωτεϊνικά προϊόντα των κλωνοποιημένων ευκαριωτικών γονιδίων ως ξένους και τα καταστρέφουν.  Αλλος είναι ότι prokaryotes δεν πραγματοποιούν τα ίδια είδη τροποποίησης posttranslational όπως eukaryotes.  Παραδείγματος χάριν, μια πρωτεϊ'νη που θα συνδεόταν συνήθως με τις ζάχαρες σε ένα ευκαριωτικό κύτταρο θα εκφραστεί ως γυμνή πρωτεϊ'νη όταν κλωνοποιείται στα βακτηρίδια.  Αυτό μπορεί να επηρεάσει μια πρωτεϊνική’δραστηριότητα ή τη σταθερότητα του s, ή τουλάχιστον την απάντησή του στα αντισώματα.  Ένα σοβαρότερο πρόβλημα είναι ότι το εσωτερικό ενός βακτηριακού κυττάρου δεν είναι τόσο συμβάλλον στο κατάλληλο δίπλωμα των ευκαριωτικών πρωτεϊνών όσο το εσωτερικό ενός ευκαριωτικού κυττάρου.  Συχνά, το αποτέλεσμα είναι εσφαλμένα διπλωμένα, ανενεργά προϊόντα των κλωνοποιημένων γονιδίων. 

Τα ευκαριωτικά συστήματα για την έκφραση της πρωτεϊ'νης περιλαμβάνουν:

• ζύμη
• μαστοφόρα κύτταρα
• κύτταρα baculovirus (έντομο)

Όλα αυτά τα συστήματα είναι μεγάλα ευκαριωτικά συστήματα για την έκφραση των ανασυνδυαζόμενων πρωτεϊνών.
Τα πλεονεκτήματα των ευκαριωτικών πρωτεϊνικών συστημάτων έκφρασης περιλαμβάνουν το γεγονός ότι μπορείτε να πάρετε τα πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης. Οι πρωτεϊ'νες είναι εύκολο να καθαριστούν τη χρησιμοποίηση των ειδικών ετικεττών που συμπεριλαμβάνονται στα διανύσματα συμπεριλαμβανομένων δικών του, Myc και άλλων ετικεττών.

Μπορείτε ακόμη και να αγοράσετε τα πλασμίδια που εκκρίνουν την πρωτεϊ'νη σας στα μέσα. Επομένως μπορείτε να συνεχίσετε το σύστημά σας και τα μέσα χωρίς lysing τα κύτταρά σας. Δεν υπάρχει κανένας οργανισμός συνυπολογισμού για να ανησυχήσει για και οι πρωτεϊ'νες σας έχουν τις άθικτες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Αυτοί είναι ζωτικής σημασίας εάν μελετάτε τη λειτουργία πρωτεϊνικές ή/και πρωτεϊνικός-πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις.

Τα μειονεκτήματα των ευκαριωτικών πρωτεϊνικών συστημάτων έκφρασης περιλαμβάνουν το γεγονός ότι τα ευκαριωτικά κύτταρα γίνονται πιό αργά από τα prokaryotic κύτταρα.

Διανύσματα έκφρασης με τους ισχυρούς υποστηρικτές

Η βασική λειτουργία ενός διανύσματος έκφρασης είναι να παραχθεί το προϊόν ενός γονιδίου - συνήθως, το περισσότερο προϊόν ο καλύτερος.  Επομένως, τα διανύσματα έκφρασης είναι συνήθως εξοπλισμένα με τους πολύ ισχυρούς υποστηρικτές η λογική είναι ότι το περισσότερο mRNA που παράγεται, το πιό πρωτεϊνικό προϊόν θα γίνει.
Ένας τέτοιος ισχυρός υποστηρικτής είναι ο υποστηρικτής trp (tryptophan operon).  Αποτελεί τη βάση για διάφορα διανύσματα έκφρασης, συμπεριλαμβανομένου ptrpL1.  Ακολουθεί μια περιοχή γονιδίων-υποκινητών/χειριστών trp, από μια περιοχή συσχετισμών ριβοσωμάτων, και μπορεί να χρησιμοποιηθεί άμεσα ως διάνυσμα έκφρασης με την παρεμβολή ενός ξένου γονιδίου στην περιοχή ClaI. Εναλλακτικά, η περιοχή ελέγχου trp μπορεί να γίνει “φορητή” με να κόψει τον έξω με ClaI και HindIII και την παρεμβολή του μπροστά από ένα γονίδιο που εκφράζεται σε ένα άλλο διάνυσμα

Inducible διανύσματα έκφρασης

Είναι συνήθως συμφέρον να κρατήσει ένα κλωνοποιημένο γονίδιο έως ότου είμαστε αναμένουμε για να το εκφράσουμε.  Ένας λόγος είναι ότι οι ευκαριωτικές πρωτεϊ'νες που παράγονται σε μεγάλες ποσότητες στα βακτηρίδια μπορούν να είναι τοξικές.  Ακόμα κι αν αυτές οι πρωτεϊ'νες δεν είναι πραγματικά τοξικές, μπορούν να ενισχύσουν στα μεγάλα επίπεδα του Αουχ ότι παρεμποδίζουν τη βακτηριακή αύξηση.  Σε καθεμία περίπτωση, εάν το κλωνοποιημένο γονίδιο επιτράπηκε για να παραμείνει ανοιγμένο συνεχώς, τα βακτηρίδια που αντέχουν το γονίδιο δεν θα αυξάνονταν ποτέ σε μια αρκετά μεγάλη συγκέντρωση για να παραγάγουν τις σημαντικές ποσότητες πρωτεϊνικού προϊόντος.  Η λύση είναι να κρατηθεί το κλωνοποιημένο γονίδιο κλειμένο με να τοποθετήσει το προς τα κάτω ενός inducible γονιδίου-υποκινητή που μπορεί να κλειθεί.
Ο υποστηρικτής λάκκας είναι inducible μέχρι ένα σημείο, πιθανώς υπόλοιπος μακριά μέχρι υποκινημένος από το συνθετικό isopropylthiogalactoside επαγωγέων (IPTG).  Εντούτοις, η καταστολή που προκαλείται από repressor λάκκας είναι ελλιπής, και κάποια έκφραση του κλωνοποιημένου γονιδίου θα παρατηρηθεί ακόμη και ελλείψει του επαγωγέα.  Ένας τρόπος γύρω από αυτό το πρόβλημα είναι να εκφραστεί το γονίδιό μας σε ένα πλασμίδιο ή phagemid που φέρνει το γονίδιο lacI του, όπως pBS.  Υπερβολικό repressor που παράγεται από ένα τέτοιο διάνυσμα κρατά το κλωνοποιημένο γονίδιό μας κλειμένο έως ότου είμαστε αναμένουμε για να το προκαλέσουμε με IPTG.
Μια άλλη στρατηγική είναι να χρησιμοποιηθεί ένας στενά ελεγχόμενος υποστηρικτής ωσ λ phage υποστηρικτή PL. Τα διανύσματα έκφρασης με αυτό το σύστημα γονιδίων-υποκινητών/χειριστών κλωνοποιούνται στα κύτταρα ξένιου χ/υ που αντέχουν ένα θερμοκρασία-ευαίσθητο λ repressor γονίδιο (c1857).  Εφ' όσον κρατάμε τη θερμοκρασία αυτών των κυττάρων σχετικά χαμηλών (32°C), repressor λειτουργεί, και καμία έκφραση δεν πραγματοποιείται.  Εντούτοις, όταν αυξάνουμε τη θερμοκρασία στο nonpermissive επίπεδο (42ºΓ), θερμοκρασία-ευαίσθητο repressor δεν μπορούν πλέον να λειτουργήσουν και το κλωνοποιημένο γονίδιο προκαλείται.

Διανύσματα έκφρασης που παράγουν τις πρωτεϊ'νες τήξης

Όταν τα περισσότερα διανύσματα έκφρασης λειτουργούν, παράγουν τις πρωτεϊ'νες τήξης.  Αυτό να φανεί πρώτα ένα μειονέκτημα επειδή το φυσικό προϊόν του γονιδίου δεν γίνεται.  Εντούτοις, τα πρόσθετα αμινοξέα στην πρωτεϊ'νη τήξης μπορούν να είναι μεγάλες οδηγίες στον καθαρισμό του πρωτεϊνικού προϊόντος.

Εξετάστε τα διανύσματα έκφρασης οληγο-χηστηδηνε, ένα από τα οποία έχει το εμπορικό φίρμα pTrcHis.  Αυτοί έχουν μια σύντομη ακολουθία ακριβώς προς τα πάνω της πολλαπλάσιας περιοχής κλωνοποίησης που κωδικοποιεί ένα τέντωμα έξι histidines.  Κατά συνέπεια, μια πρωτεϊ'νη που εκφράζεται σε ένα τέτοιο διάνυσμα θα είναι μια πρωτεϊ'νη τήξης με έξι histidines στο αμινο τέλος της.  Γιατί θα θέλαμε να συνδέσουμε έξι histidines με την πρωτεϊ'νη μας;  Οι περιοχές οληγο-χηστηδηνε όπως αυτό έχουν μια υψηλή συγγένεια για τα μέταλλα όπως το νικέλιο, έτσι μπορούμε να καθαρίσουμε τις πρωτεϊ'νες που έχουν τέτοιες περιοχές που χρησιμοποιούν τη χρωματογραφία συγγένειας νικελίου.  Η ομορφιά αυτής της μεθόδου είναι η απλότητα και η ταχύτητά της.  Αφότου έχουν κάνει τα βακτηρίδια την πρωτεϊ'νη τήξης, lyse απλά αυτοί, προσθέτουμε το srude που το βακτηριακό απόσπασμα σε μια στήλη συγγένειας νικελίου, πλένει έξω όλες τις απεριόριστες πρωτεϊ'νες, κατόπιν έκδοση η πρωτεϊ'νη τήξης με histidine ή ένα histidine ανάλογο αποκαλούμενο imidazole.  Αυτή η διαδικασία επιτρέπει σε μας για να συγκομίσει ουσιαστικά την καθαρή τήξη μόνο σε ένα βήμα.  Αυτό είναι δυνατό επειδή πολύ λίγος εάν οποιεσδήποτε φυσικές πρωτεϊ'νες έχουν τις περιοχές οληγο-χηστηδηνε, έτσι την πρωτεϊ'νη τήξης μας είναι ουσιαστικά μοναδικός που δεσμεύει στη στήλη.

Τι εάν θέλουμε την πρωτεϊ'νη μας χωρίς ετικέττα οληγο-χηστηδηνε; 

Οι σχεδιαστές αυτών των διανυσμάτων έχουν παράσχει σκεπτικά έναν τρόπο να τον αφαιρέσουν.  Αμέσως πριν από την πολλαπλάσια περιοχή κλωνοποίησης, υπάρχει μια περιοχή κωδικοποίησης για ένα τέντωμα των αμινοξέων που αναγνωρίζεται από το proteolytic ενζυμικό enterokinase.  Έτσι μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε το enterokinase για να διασπάσουμε την πρωτεϊ'νη τήξης σε δύο μέρη:  η ετικέττα οληγο-χηστηδηνε και η πρωτεϊ'νη που θέλουμε. Η περιοχή που αναγνωρίζεται από το enterokinase είναι πολύ σπάνια, και η πιθανότητα ότι υπάρχει στην πρωτεϊ'νη μας είναι ασήμαντη.  Κατά συνέπεια, η πρωτεϊ'νη μας δεν πρέπει να τεμαχιστεί επάνω δεδομένου ότι αφαιρούμε την ετικέττα οληγο-χηστηδηνε της.  Εάν θέλουμε, μπορούμε να τρέξουμε την εντεροκηνασε-διασπασμένη πρωτεϊ'νη μέσω της στήλης νικελίου για να χωρίσουμε ακόμα μια φορά τα τεμάχια οληγο- hisitidine από την πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντος.

λ οι βακτηριοφάγοι έχουν χρησιμεύσει επίσης ως η βάση για τα διανύσματα έκφρασης  το ένα που σχεδιάζεται συγκεκριμένα για αυτόν το λόγο είναι λgt11.  Αυτός ο βακτηριοφάγος περιέχει μια περιοχή ελέγχου λάκκας που ακολουθείται από το γονίδιο lacZ.  Οι περιοχές κλωνοποίησης βρίσκονται μέσα στο γονίδιο lacZ, έτσι τα προϊόντα ενός γονιδίου που παρεμβάλλεται σε αυτό το διάνυσμα θα είναι πρωτεϊ'νες τήξης με έναν ηγέτη της β-γαλακτοξιδάσης.
Η έκφραση διανυσματικό λgt11 έχει γίνει ένα δημοφιλές όχημα για και τις βιβλιοθήκες DNA διαλογής.  λgt11 επιτρέπει σε μας για να καλύψει μια ομάδα κλώνων άμεσα για την έκφραση της σωστής πρωτεϊ'νης.  Τα βασικά συστατικά που απαιτούνται για αυτήν την διαδικασία είναι βιβλιοθήκη DNA λgt11 και ένας αντιορός που κατευθύνεται ενάντια στην πρωτεϊ'νη ενδιαφέροντος.
Καλύπτουμε τους βακτηριοφάγους λ μας με τα διάφορα ένθετα DNA και λεκιάζουμε τις πρωτεϊ'νες που καταβάλλονται κατά κάθε κλώνο επάνω σε μια υποστήριξη όπως nitrocellulose.  Μόλις μεταφέρουμε τις πρωτεϊ'νες από κάθε πινακίδα nitrocellulose, εξετάζουμε με τον αντιορό μας.  Έπειτα, ψάχνουμε το αντίσωμα που δεσμεύεται στην πρωτεϊ'νη από μια ιδιαίτερη πινακίδα, χρησιμοποιώντας το επονομαζόμενο πρωτεϊνικό Α από το σταφυλόκοκκο χρυσό.  Αυτή η πρωτεϊ'νη δεσμεύει στενά στο αντίσωμα και ονομάζει το αντίστοιχο σημείο nitrocellulose.  Ανιχνεύουμε αυτήν την ετικέτα από autoradiography ή με, κατόπιν πηγαίνουμε στο κύριο πιάτο μας και επιλέγουμε την αντίστοιχη πινακίδα.  Σημειώστε ότι ανιχνεύουμε μια πρωτεϊ'νη τήξης, όχι η πρωτεϊ'νη το ίδιο ενδιαφέροντος.  Επιπλέον, δεν πειράζει εάν έχουμε κλωνοποιήσει ολόκληρο ένα DNA ή όχι.  Ο αντιορός μας είναι ένα μίγμα αντισωμάτων που θα αντιδράσει με διάφορα διαφορετικά μέρη της πρωτεϊ'νης μας, τόσο ακόμη και ένα μερικό γονίδιο θα κάνει, εφ' όσον κλωνοποιείται η περιοχή κωδικοποίησής της στο ίδιο πλαίσιο προσανατολισμού και ανάγνωσης με την περιοχή κωδικοποίησης β-γαλακτοξιδάσης.

Για μια γρήγορη ανασυνδυαζόμενη πρωτεϊνική αναθεώρηση έκφρασης δείτε:

Ανασυνδυαζόμενα πρωτεϊνικά συστήματα

Μοριακός © σταθμός 2006 πνευματικών δικαιωμάτων