Υποδοχή στο μοριακό σταθμό!

Πρέπει να καταχωρήσετε προτού να μπορέσετε να ταχυδρομήσετε στα φόρουμ μας ή να χρησιμοποιήσετε τα προηγμένα χαρακτηριστικά γνωρίσματά μας. Κατάλογος τώρα! Ελεύθερος και γρήγορος του!

Ήδη καταχωρημένος; Αδεια εισόδου τώρα κατωτέρω.

Όνομα χρηστών:

Κωδικός πρόσβασης:

Με θυμηθείτε;

Ήδη καταχωρημένος και ξέχασε τον κωδικό πρόσβασής σας; Χτυπήστε κατωτέρω για να το ανακτήσετε.

Ανακτήστε το χαμένο κωδικό πρόσβασης

Ενώστε τώρα - είναι γρήγορο και ελεύθερο!

Ο μοριακός σταθμός είναι το μεγαλύτερο δίκτυο ερευνητών, επιστημόνων και εραστών επιστήμης οπουδήποτε!

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

 

Πρωτόκολλα DNA

Εγκυκλοπαίδεια DNA

Βιοπληροφορική DNA

Φόρουμ DNA

DNA Blog

Ειδήσεις DNA

Βιβλία DNA

 

Νότιος λεκές

Μοριακός σταθμός πνευματικών δικαιωμάτων 2007

Υπόβαθρο στο νότιο λέκιασμα

Ιστορία της νότιας τεχνικής λεκέδων

Το νότιο λέκιασμα είναι μια τεχνική που ονομάζεται μετά από τον εφευρέτη του και ο υπεύθυνος για την ανάπτυξη, ο βρετανικός βιολόγος Edwin M. Southern στο νότιο λέκιασμα 1975, είναι μια τεχνική που επιτρέπει την ανίχνευση μιας συγκεκριμένης ακολουθίας DNA (γονίδιο ή άλλη) σε ένα μεγάλο, σύνθετο δείγμα του DNA (π.χ. κυψελοειδές DNA).

"Πριν από pcr και τη φτηνή γρήγορη αλληλοuχία άλλαξε την όψη μας του κόσμου που είναι γενετική, ο νότιος λεκές ήταν καθολικό workhorse. Δεν υπήρξε ένα πείραμα στη μοριακή γενετική που δεν χρησιμοποίησε σε κάποιο σημείο έναν νότιο λεκέ. Είναι ακόμα ένα χρήσιμο εργαλείο και πρέπει να ξέρετε για το έτσι ώστε μπορείτε να ερμηνεύσετε τα ιστορικά στοιχεία."

Νότια λεκιάζοντας διαδικασία

Το διάγραμμα του νότιου αριθμού τεχνικής λεκέδων είναι πνευματικά δικαιώματα. Εάν θα επιθυμούσατε να το χρησιμοποιήσετε για ένα πρόγραμμα διάλεξης ή επιστήμης, παρακαλώ μας ελάτε σε επαφή με για τη δικαιοδοσία.

Στο βήμα 1, το DNA αφομοιώνεται με τις ενδονουκλεάσεις περιορισμού. Το high-molecular-weight DNA αφομοιώνεται στα μικρότερα τεμάχια.

Στο βήμα 2, το DNA χωρίζεται έπειτα έξω από το μέγεθος από την ηλεκτροφόρηση σε ένα πήκτωμα αγαρόζης.

Στο βήμα 3, ένα φύλλο της μεμβράνης νάυλον ή nitrocellulose (πορφυρής) τοποθετείται πάνω από το πήκτωμα αγαρόζης σε ένα ρυθμιστικό διάλυμμα. Αυτό εξετάζεται το στάδιο λεκιάσματος ή μεταφοράς. Η πίεση εφαρμόζεται ομοιόμορφα σε το πήκτωμα χρησιμοποιώντας είτε την αναρρόφηση είτε με την τοποθέτηση μιας στοίβας των πετσετών εγγράφου και ενός βάρους πάνω από τη μεμβράνη και το πήκτωμα για να εξασφαλίσει ακόμη και επαφή μεταξύ του πηκτώματος και της μεμβράνης. Η μεταφορά προσωρινών χώρων από την τριχοειδή ενέργεια από μια περιοχή της υψηλής δυνατότητας ύδατος σε μια περιοχή της χαμηλής δυνατότητας ύδατος (συνήθως έγγραφο φίλτρων και ιστοί εγγράφου) χρησιμοποιείται έπειτα για να κινήσει το DNA από το πήκτωμα προς τη μεμβράνη. Η θετικά χρεωμένη μεμβράνη (πορφυρή) χρησιμοποιείται συνήθως που επιτρέπει στο DNA για να δεσμεύσει με την υψηλή συγγένεια στη μεμβράνη μέσω των ιονικών αλληλεπιδράσεων μεταξύ του αρνητικά χρεωμένου DNA και της θετικά χρεωμένης μεμβράνης.

Στο βήμα 4, nitrocellulose οι μεμβράνες ψήνονται από την έκθεση στις υψηλές θερμοκρασίες (από 60 έως 100 °C). Οι νάυλον μεμβράνες εκτίθενται στην UV ακτινοβολία. Αυτά τα βήματα χρησιμοποιούνται για να εξασφαλίσουν τη μόνιμη και ομοιοπολική διασύνδεση του DNA παρόντος στις ζώνες στις μεμβράνες.

Στο βήμα 5, η μεμβράνη εκτίθεται σε έναν ραδιενεργό έλεγχο. Αυτός ο έλεγχος είναι ένα single-stranded τεμάχιο DNA που έχει την ακολουθία ενδιαφέροντός σας που θέλετε να ανιχνεύσετε. Αυτός ο έλεγχος επωάζεται με τη μεμβράνη και επιτρέπεται για να υβριδιοποιήσει με το DNA στη μεμβράνη. Οι έλεγχοι είναι συνήθως ραδιενεργοί έτσι ώστε μπορούν να ανιχνευθούν στην ταινία, εντούτοις οι νεώτεροι έλεγχοι χρησιμοποιούνται επίσης που είναι μη-ραδιενεργοί όπως οι φθορισμού ή χρωμογενείς χρωστικές ουσίες. Μετά από την υβριδοποίηση, ο υπερβολικός απεριόριστος έλεγχος πλένεται μακρυά από τη μεμβράνη, αφήνοντας το συγκεκριμένα συνδεδεμένο έλεγχο.

Στο βήμα 6, το πρότυπο της υβριδοποίησης ανιχνεύεται από την απεικόνιση στην των ακτίνων X ταινία από autoradiography στην περίπτωση τους ραδιενεργούς ή φθορισμού ελέγχους, ή από την ανάπτυξη του χρώματος στη μεμβράνη εάν μια χρωμογενής μέθοδος ανίχνευσης χρησιμοποιείται.

(Σημειώσεις για το βήμα 3: εάν τα μεγάλα τεμάχια DNA είναι παρόντα μεγαλύτερα από 15 KB στο μέγεθος μπορούν να είναι έως τότε το αραιό οξύ HCl πριν από το λέκιασμα που θα σπάσει το DNA στα μικρότερα κομμάτια, επιτρέποντας κατά συνέπεια την αποδοτικότερη μεταφορά από το πήκτωμα στη μεμβράνη. Εάν οι αλκαλικές μέθοδοι μεταφοράς χρησιμοποιούνται, το πήκτωμα DNA τοποθετείται σε μια αλκαλική λύση (χαρακτηριστικά που περιέχει το υδροξείδιο νατρίου) για να μετουσιώσει το double-stranded DNA. Η αλλοίωση σε ένα αλκαλικό περιβάλλον προβλέπει το βελτιωμένο συσχετισμό του αρνητικά χρεωμένου DNA σε μια θετικά χρεωμένη μεμβράνη, το χωρίζει στα ενιαία σκέλη DNA για την πιό πρόσφατη υβριδοποίηση στον έλεγχο (δείτε κατωτέρω), και καταστρέφει οποιοδήποτε υπόλοιπο RNA που μπορεί ακόμα να είναι παρόν στο DNA.

Επισκόπηση

ΗΧΟΣ: Ακούστε μια λεπτομερή νότια εξήγηση λεκέδων! Ευγένεια: Εθνικό ανθρώπινο ερευνητικό ίδρυμα γονιδιώματος.

Όπως αναφέρεται, ο νότιος λεκές είναι μια τεχνική που χρησιμοποιείται για να προσδιορίσει και να εντοπίσει τις ακολουθίες DNA που συμπληρώνουν ένα άλλο κομμάτι του DNA αποκαλούμενο έλεγχο.

Ο χωρισμός σε ένα ηλεκτροφορητικό πήκτωμα των ακολουθιών ή τα τεμάχια του genomic ή συμπληρωματικού DNA, που αφομοιώνονται μερικώς από τις ενδονουκλεάσεις, τα τεμάχια έπειτα "λεκιάζεται" επάνω σε μια μεμβράνη και επιτρέπεται για να υβριδιοποιήσει με έναν συγκεκριμένο, επονομαζόμενος τον έλεγχο προκειμένου να ανιχνευθεί ποιος ζώνες περιέχουν το τεμάχιο ή το γονίδιο ενδιαφέροντος. Ο νότιος λεκές είναι ιδιαίτερα χρήσιμος στην ανίχνευση των μεγάλων αναδιοργανώσεων/των διαγραφών γονιδίων και το μεγάλο trinucleotide επαναλαμβάνει τις επεκτάσεις.

Ένας νότιος λεκές είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται συνήθως στη μοριακή βιολογία για να ελέγξει για την παρουσία μιας ακολουθίας DNA σε ένα δείγμα DNA. Το νότιο λέκιασμα συνδυάζει την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων αγαρόζης για το χωρισμό μεγέθους του DNA με τις μεθόδους για να μεταφέρει το μέγεθος-χωρισμένο DNA σε μια μεμβράνη φίλτρων για την υβριδοποίηση ελέγχων. Αλλες λεκιάζοντας μέθοδοι (δηλ., δυτικός λεκές, βόρειος λεκές, νοτιοδυτικός λεκές) που υιοθετούν τις παρόμοιες αρχές, αλλά η χρησιμοποίηση του RNA ή της πρωτεϊ'νης, έχει ονομαστεί αργότερα στην αναφορά στο νότιο όνομα. Δεδομένου ότι η τεχνική ονομάστηκε eponymously, ο νότιος λεκές πρέπει να κεφαλαιοποιηθεί, ενώ οι βόρειοι και δυτικοί λεκέδες δεν πρέπει.

Χρησιμοποιείται επίσης για να καθορίσει το μοριακό βάρος ενός τεμαχίου περιορισμού και για να μετρήσει τα σχετικά ποσά στα διαφορετικά δείγματα.

Οι λεκέδες είναι τεχνικές για τις πρωτεϊ'νες DNA και RNA επάνω σε έναν μεταφορέα έτσι μπορούν να χωριστούν, και ακολουθούν συχνά τη χρήση μιας ηλεκτροφόρησης πηκτωμάτων. Ο νότιος λεκές χρησιμοποιείται για τη μεταφορά του DNA.

Η υβριδοποίηση του ελέγχου σε ένα συγκεκριμένο τεμάχιο DNA στη μεμβράνη φίλτρων δείχνει ότι αυτό το τεμάχιο περιέχει την ακολουθία DNA που συμπληρώνει τον έλεγχο.

Εφαρμογές της νότιας μεθόδου λεκέδων

Οι νότιοι λεκέδες χρησιμοποιούνται σε διάφορες βασικές περιοχές συμπεριλαμβανομένων των μελετών ανακαλύψεων και χαρτογράφησης γονιδίων, εξέλιξης και ανάπτυξης, των διαγνωστικών και των ιατροδικαστικών.

• Οι νότιοι λεκέδες επιτρέπουν στους ανακριτές για να καθορίσουν το μοριακό βάρος ενός τεμαχίου περιορισμού και για να μετρήσουν τα σχετικά ποσά στα διαφορετικά δείγματα.
• Ο νότιος λεκές χρησιμοποιείται για να ανιχνεύσει την παρουσία ενός ιδιαίτερου δυαδικού ψηφίου του DNA σε ένα δείγμα
• αναλύστε τα γενετικά πρότυπα που εμφανίζονται στο DNA ενός προσώπου.
• αναλύστε τον τεμαχισμό πέψης περιορισμού του DNA ή ενός βιολογικού δείγματος
• Στους σεβασμούς στους γενετικά τροποποιημένους οργανισμούς, το νότιο λέκιασμα χρησιμοποιείται ως οριστική δοκιμή για να εξασφαλίσει ότι ένα ιδιαίτερο τμήμα του DNA της γνωστής γενετικής ακολουθίας έχει ενσωματωθεί επιτυχώς στο γονιδίωμα του οργανισμού ξένιου χ/υ.

Όριο ανίχνευσης του νότιου λεκιάσματος

Υπό τους βέλτιστους όρους, το νότιο λέκιασμα ανιχνεύει ~ 0,1 PG του DNA ενδιαφέροντος

Νότιες συνταγές προσωρινών χώρων λεκέδων

προσωρινός χώρος 20X SSC

Για να κάνει 1 λίτρο του προσωρινού χώρου 20X SSC, προσθέστε τα εξής:

• 3M NaCl: 175,3 γ
• Κιτρικό άλας NA 0.15M: 88,2 γ
• dH2O: 800 mls
• pH σε 7,0 με HCl (0.1-0.5 mLs περ..)

Νότιο πρωτόκολλο λεκέδων

1. Πήκτωμα φωτογραφιών με τον κυβερνήτη.
2. Μετουσιώστε το πήκτωμα για 30 mins rt (temp δωματίων), τινάζοντας, με 0,5 μ NaOH, 1,5 μ NaCl
3. Ξέβγαλμα με H2O τους χρόνους 2x-3x
4. Εξουδετερώστε: 30 λεπτά, rt, τίναγμα
5. Εξουδετερώνοντας, η μεμβράνη αποκοπών για να εγκαταστήσει το πήκτωμα, έκοψε το έγγραφο 3mm (3-4 φύλλα) στο μέγεθος του πηκτώματος, προετοιμάζει τις κατάλληλες πετσέτες εγγράφου μεγέθους για το λέκιασμα.
6. Οργανώστε το λέκιασμα: 2 στρώματα του εγγράφου 3mm ως φυτίλια σε 20X SSC. Το πήκτωμα πάνω από τα φυτίλια, αφαιρεί οποιαδήποτε ψuψψλεσΠρε-βρεγμένη μεμβράνη (σε 2xSSC) πάνω από το πήκτωμα
7. έγγραφο 3mm πάνω από τη μεμβράνη, πετσέτες εγγράφου πάνω από το έγγραφο 3mm. 500g βάρος πάνω από τις πετσέτες εγγράφου.
8. 6-18 ώρες που λεκιάζουν
9. Το ξηρό φίλτρο αέρα, UV ακτινοβολεί 3,5 λ.
10. Φίλτρο πλυσίματος σε καυτό 2x SSC 0,1% SDS δύο φορές

Ανίχνευση λαθών και προβλήματα; Δείτε το footprinting DNAse φόρουμ!

Για τα προβλήματα και το νότιο λέκιασμα ανίχνευσης λαθών, ταχυδρομήστε ένα νέο νήμα για να το συζητήσετε στο νότιο λεκιάζοντας φόρουμ!

Πρωτόκολλα και μέθοδοι άλλα DNA

Οδηγός κλωνοποίησης DNA

Ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων DNA

Η ενζυμική πέψη περιορισμού - όλοι εσείς πρέπει να ξέρεϊ

Πρωτόκολλο απομόνωσης DNA Genomic

Απομόνωση DNA Baceteria