Δοκιμάζοντας το DNA - πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις

Μάθετε για το πώς να δοκιμάσει τις DNA-PRWTEJ!NJKE'S αλληλεπιδράσεις.

Να δοκιμάσει αλληλεπιδράσεις DNAProtein

Υπάρχουν τέσσερις σημαντικές τεχνικές για να δοκιμάσουν τις DNA-PRWTEJ!NJKE'S αλληλεπιδράσεις. Οι πρώτες δύο τεχνικές (μετατόπιση κινητικότητας συσχετισμών και πηκτωμάτων φίλτρων) καθορίζουν εάν το DNA σας αλληλεπιδρά με την πρωτεϊ'νη. Οι άλλες δύο τεχνικές (footprinting DNase και DMS footprinting) δείχνουν όπου η περιοχή στόχων της αλληλεπίδρασης μεταξύ της πρωτεϊ'νης και του DNA βρίσκεται στο DNA.

Συσχετισμός φίλτρων

Nitrocellulose τα φίλτρα μεμβρανών χρησιμοποιούνται συνήθως για να αποστειρώσουν με φιλτράρισμα τις λύσεις. Nitrocellulose τα φίλτρα μπορούν να δεσμεύσουν το DNA, αλλά μόνο υπό ορισμένους όρους. Το singlestranded DNA δεσμεύει εύκολα nitrocellulose, αλλά προσαραγμένο το διπλάσιο DNA από το όχι. Αφ' ετέρου η πρωτεϊ'νη δεσμεύει, και εάν μια πρωτεϊ'νη είναι συνδεδεμένη στο double-stranded DNA το πρωτεϊνικός-DNA σύνθετο θα δεσμεύσει. Παρακαλώ αναφερθείτε nitrocellulose στο δεσμευτικό άρθρο δοκιμής φίλτρων για περισσότερες πληροφορίες.

Πήξτε τη μετατόπιση κινητικότητας

Προκειμένου να μετρηθούν οι DNA-PRWTEJ!NJKE'S αλληλεπιδράσεις αυτή η τεχνική στηρίζεται στο απλό γεγονός ότι ένα μικρό DNA έχει μια πολύ υψηλότερη κινητικότητα στην ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων από το ίδιο DNA κάνει όταν δεσμεύεται σε μια πρωτεϊ'νη. Επομένως μπορούμε να ονομάσουμε ένα προσαραγμένο τεμάχιο DNA είδους διπλάσιο, κατόπιν μίγμα αυτό με μια πρωτεϊ'νη, και electrophorese το συγκρότημα. Κατόπιν υποβάλλουμε το πήκτωμα autoradiography για να ανιχνεύσουμε τα επονομαζόμενα είδη. Το μικρό μέγεθος του DNA είναι σημαντικό σε αυτήν την δοκιμή. Εάν ολόκληρο ένα γονίδιο χρησιμοποιήθηκε η κινητικότητά της θα ήταν ήδη πολύ χαμηλή, και η μετατόπιση κινητικότητας που προκαλείται από τον πρωτεϊνικό συσχετισμό θα ήταν δύσκολο να ανιχνευθεί. Επομένως πρέπει να ξέρουμε περίπου όπου η πρωτεϊ'νη δεσμεύει στο DNA έτσι μπορούμε να προετοιμάσουμε ένα κοντό τεμάχιο περιορισμού, ή ακόμα και συνθετικό double-stranded oligonucleotide που περιέχουν την περιοχή στόχων για την πρωτεϊ'νη, αλλά ελάχιστα αλλιώς.

DNase footprinting

Μόλις ξέρουμε ότι μια πρωτεϊ'νη δεσμεύει σε ένα δεδομένο DNA μπορούμε να χρησιμοποιήσουμε footprinting για να ανακαλύψουμε όπου η περιοχή στόχων βρίσκεται στο DNA. Dnase footprinting στηρίζεται στο γεγονός ότι μια πρωτεϊ'νη, με τη δέσμευση στο DNA, καλύπτει την περιοχή συσχετισμών και την προστατεύει έτσι από την επίθεση από dnase. Από αυτή την άποψη αφήνει ένα "ίχνοσ" στο DNA. Το πρώτο βήμα σε ένα footprinting πείραμα είναι τέλος-ετικέτα το DNA. Μπορούμε να ονομάσουμε το καθένα προσαράσσουμε, αλλά μόνο ένας ανά πείραμα. Έπειτα, δεσμεύουμε την πρωτεϊ'νη στο DNA. Κατόπιν μεταχειριζόμαστε το DNA-PRWTEJ!NJKO' συγκρότημα με dnase Ι υπό τους ήπιους όρους (πολύ λίγο dnase), έτσι ώστε ένας μέσος όρος μόνο του ενός που κόβεται εμφανίζεται ανά μόριο DNA. Έπειτα, αφαιρούμε την πρωτεϊ'νη από το DNA, χωρίζουμε τα σκέλη DNA, και electrophorese τα προκύπτοντα τεμάχια σε ένα polyacylamide υψηλού ψηφίσματος πήζουν παράλληλα με τους δείκτες μεγέθους. Τα τεμάχια θα προκύψουν από το άλλο τέλος του DNA επίσης, αλλά δεν θα τους ανιχνεύσουμε επειδή είναι unlabeled. Περιλαμβάνουμε πάντα έναν έλεγχο με το DNA μόνο (καμία πρωτεϊ'νη), και χρησιμοποιούμε συνήθως περισσότερες από μια πρωτεϊνικές συγκεντρώσεις έτσι μπορούμε να δούμε από τη βαθμιαία εξαφάνιση των ζωνών στην περιοχή ίχνους ότι η προστασία του DNA εξαρτάται από τη συγκέντρωση της προστιθέμενης πρωτεϊ'νης. Το ίχνος αντιπροσωπεύει την περιοχή του DNA που προστατεύεται από την πρωτεϊ'νη, και επομένως μας λέει όπου η πρωτεϊ'νη δεσμεύει.

DMS footprinting

Dnase footprinting δίνει μια καλή ιδέα της θέσης της περιοχής συσχετισμών για την πρωτεϊ'νη, αλλά dnase είναι ένα μακρομόριο και είναι επομένως ένα μάλλον αμβλύ όργανο για την εξέταση των λεπτών λεπτομερειών της περιοχής συσχετισμών. Ποια μέσα, ότι μπορούν να υπάρξουν χάσματα στην αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεϊ'νης και του DNA στις οποίες dnase δεν θα άρμοζε και επομένως δεν θα ανίχνευε. Επιπλέον, οι δεσμευτικές πρωτεϊ'νες DNA διαταράσσουν συχνά το DNA μέσα στη δεσμευτική περιοχή, διαστρεβλώνοντας το διπλό έλικα. Αυτές οι διαταραχές είναι ενδιαφέρουσες, αλλά δεν ανιχνεύονται γενικά από dnase footprinting επειδή η πρωτεϊ'νη κρατά dnase μακριά. Για να κάνουμε πιό λεπτομερές footprinting, χρειαζόμαστε ένα μικρότερο μόριο που μπορεί να αρμόσει στις γωνίες και τις σχισμές DNA-PRWTEJ!NJKOY' του σύνθετου και να αποκαλύψει περισσότερων των οξυνοιών της αλληλεπίδρασης. Ένα αγαπημένο εργαλείο για αυτήν την εργασία είναι ο μεθυλιώνοντας πράκτορας dimethylsulfate (DMS).

Με DMS footprinting αρχίζουμε με τον ίδιο τρόπο όπως dnase footprinting, με τα τέλη τουμαρκάρισμα του DNA και τη δέσμευση της πρωτεϊ'νης. Κατόπιν μεθυλιώνουμε το DNA-PRWTEJ!NJKO' συγκρότημα με DMS, χρησιμοποιώντας μια ήπια επεξεργασία έτσι ώστε κατά μέσον όρο μόνο μια μεθυλίωση εμφανίζεται ακόμη και ανά μόριο DNA. Έπειτα, αποσπάμε την πρωτεϊ'νη, και μεταχειριζόμαστε το DNA με ένα αντιδραστήριο που αφαιρεί μεθυλιωμένα purines, δημιουργώντας τις apurinic περιοχές (deoxyriboses χωρίς βάσεις) στο DNA. Κατόπιν σπάζουμε το DNA επί αυτών των apurinic τόπων. Αυτές οι αντιδράσεις είναι οι ίδιες με το DNA μαξαμ- Gilbert τοποθετώντας διαδοχικά τις αντιδράσεις. Τελικά electrophorese το DNA τεμαχίζουμε και autoradiograph το πήκτωμα για να ανιχνεύσουμε τις επονομαζόμενες ζώνες DNA. Κάθε ζώνη τελειώνει δίπλα σε μια νουκλεοτίδα που μεθυλιώθηκε και έτσι μη προστατευμένος από την πρωτεϊ'νη.

Δείτε το μόριο DNA στις 3-διαστάσεις

εγκυκλοπαίδεια DNA