Υποδοχή στο μοριακό σταθμό!

Πρέπει να καταχωρήσετε προτού να μπορέσετε να ταχυδρομήσετε στα φόρουμ μας ή να χρησιμοποιήσετε τα προηγμένα χαρακτηριστικά γνωρίσματά μας. Κατάλογος τώρα! Ελεύθερος και γρήγορος του!

Ήδη καταχωρημένος; Αδεια εισόδου τώρα κατωτέρω.

Όνομα χρηστών:

Κωδικός πρόσβασης:

Με θυμηθείτε;

Ήδη καταχωρημένος και ξέχασε τον κωδικό πρόσβασής σας; Χτυπήστε κατωτέρω για να το ανακτήσετε.

Ανακτήστε το χαμένο κωδικό πρόσβασης

Ενώστε τώρα - είναι γρήγορο και ελεύθερο!

Ο μοριακός σταθμός είναι το μεγαλύτερο δίκτυο ερευνητών, επιστημόνων και εραστών επιστήμης οπουδήποτε!

Πρόσφατες θέσεις φόρουμ

 

Πρωτόκολλα DNA

Εγκυκλοπαίδεια DNA

Βιοπληροφορική DNA

Φόρουμ DNA

DNA Blog

Ειδήσεις DNA

Βιβλία DNA

 

Footprinting DNA

Μοριακός σταθμός πνευματικών δικαιωμάτων 2007

Υπόβαθρο footprinting DNA

DNase footprinting είναι μια μοριακή μέθοδος της βιολογίας που επιτρέπει την ανίχνευση των DNA-PRWTEJ!NJKW'N αλληλεπιδράσεων με την εκμετάλλευση της ιδιοκτησίας ότι μια πρωτεϊ'νη που αλληλεπιδρά με το DNA θα προστατεύσει το DNA επί εκείνου του τόπου αλληλεπίδρασης από την πέψη περιορισμού ή το ενζυματικό σχίσιμο DNAase. Ένα τεμάχιο περιορισμού DNA που περιέχει τη συγκεκριμένη περιοχή συσχετισμών ονομάζεται από τη μία πλευρά, συνήθως με 32P και χρησιμοποιείται για footprinting.

Η πρωτεϊ'νη και το DNA επιτρέπονται για να υβριδιοποιήσουν και να δεσμεύσουν από κοινού.

Footprinting DNA χρησιμοποιεί το ένζυμο DNase Ι ή το ucleicόξινοnuclease ι eoxyriboν δ προκειμένου να αφομοιωθεί ή να κοπεί μακριά το ελεύθερο ραδιενεργό (ή επονομαζόμενος) DNA αφήνοντας το συνδεδεμένο πρωτεϊ'νη DNA προστατευμένο. Τα τεμάχια περιορισμού DNA αντιμετωπίζονται ελαφριά με DNase Ι, το οποίο κάνει τα μονόκλωνα σπασίματα (εγκοπές) στο DNA. Ένα μικρό ποσό ενζύμου χρησιμοποιείται έτσι ώστε υπάρχει ένας μέσος όρος λιγότερο από 1 εγκοπής/σκέλους Την αντίδραση σταματούν έπειτα, το DNA μετουσιώνεται, και το μίγμα οργανώνεται polyacrylamide μετουσίωσης τοποθετώντας διαδοχικά το πήκτωμα. Αυτά τα τεμάχια που χωρίζονται από την ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων εκτίθενται για να ανιχνεύσουν την προστατευόμενη ζώνη DNA με την ανάλυση του προτύπου σχισίματος ζώνης στο πήκτωμα.

Το πρότυπο σχισίματος του DNA ελλείψει μιας δεσμευτικής πρωτεϊ'νης DNA, χαρακτηριστικά καλούμενο το ελεύθερο DNA, συγκρίνεται με το πρότυπο σχισίματος του DNA παρουσία μιας δεσμευτικής πρωτεϊ'νης DNA. Εάν η πρωτεϊ'νη δεσμεύει το DNA, η περιοχή συσχετισμών προστατεύεται από το ενζυματικό σχίσιμο. Αυτή η προστασία θα οδηγήσει σε μια σαφή περιοχή στο πήκτωμα που αναφέρεται ως "ίχνοσ".

Με την ποικιλία της συγκέντρωσης της DNA-DESMEYTJKI'S πρωτεϊ'νης, η δεσμευτική συγγένεια της πρωτεϊ'νης μπορεί να υπολογιστεί σύμφωνα με την ελάχιστη συγκέντρωση της πρωτεϊ'νης στην οποία ένα ίχνος παρατηρείται.

DNAse footprinting συνταγές προσωρινών χώρων

DNase footprinting δεσμευτική συνταγή προσωρινών χώρων

2X w/o KCl/gja 10mls:

ποσό: [ τελικό ]
Τρης- HCl pH7.6: ul 500 1M: 50 mM
MgCl2: 125ul 1M: 12.5mM
EDTA: ul 2 0.5M: 1mM
Γλυκερίνη: 2 mls: 20%
DTT: ul 10 1M: 1 mM

Δεσμευτικός προσωρινός χώρος (προσωρινός χώρος μετατόπισης πηκτωμάτων)

5X KCL w/o
[ τελικό ]: συστατικό
20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Τρης-HCL, pH 7,5
0.25mg/ml: πολυ (dI-dC) πολυ (dI-dC)

Προσωρινός χώρος ασβεστίου/MG

Για 10mls
CaCl2: ul 50 1M: 5 mM
MgCl2: ul 100 1M: 10 mM

Λύση φόρτωσης
0,1 Μ: NaOH:formamid (1:2 v/v)
cyanol ξυλολίων 0.1%:
bromophenol 0.1%: μπλε

Σταματήστε τον προσωρινό χώρο
10mls
NaCl: ul 400 5M: 200 mM
EDTA: ul 600 0.5M: 30 mM
SDS: 1 μιλ. 10%: 1%

TEBe (τρης-εΔΤΑ-βήτα mercap.)
Τρης- HCl, pH 7,6: ul 500 1 μ: 50 mM
EDTA: 2ul 0,5 μ: 1 mM
Βήτα-μερθαπτοετχανολ: ul 10: 15mM

προσωρινός χώρος 10 Χ Κ
για 1 μιλ.
Τρης- HCl pH 7,5: ul 100 1 μ: 100 mM
MgCl2: ul 100 1 μ: 100mM
DTT: ul 50 1M: 50 mM
dH2O: ul 750

DNAse footprinting πρωτόκολλο

Το DNA χρησιμοποιούμενο συνήθως περιέχει την περιοχή συσχετισμών της πρωτεϊ'νης ενδιαφέροντός σας. Το DNA καθαρίζεται, κατόπιν αφομοιώνεται με τα τεμάχια περιορισμού για να είναι ενός μεγέθους appopriate. Το τεμάχιο DNA ονομάζεται σε ένα τέλος (περιοχή συσχετισμών > σημείο ζέσεως 25 από το τέλος).

Το ένα μαρκάρισμα σκελών μπορεί να είναι από:

1. απομονώνοντας το τεμάχιο με το ένζυμο περιορισμού (σ) που περιέχει "προεξοχή 5, ονομάζοντας με Klenow και την κατάλληλη καυτή νουκλεοτίδα. Κατόπιν αφομοίωση με ένα ένζυμο που αφαιρεί ένα τέλος.
2. η απομόνωση ενός τεμαχίου που αφομοιώνεται με ένα ένζυμο περιορισμού που δημιουργεί το τέλος 5 "και 3", που ονομάζει με Klenow θα ονομάσει μόνο "προεξοχή τα 5.
3. Όπως "στο α" αλλά με οποιοδήποτε ένζυμο και χρησιμοποίηση polynucleotide της κινάσης για να ονομάσει "τέλος 3 (κινάση) και αφομοίωση από μια από τις άκρες με ένα δεύτερο (τρίτο) ένζυμο περιορισμού.
   (ΥΠΕΝΘΥΜΙΣΗ: εάν ονομάζοντας με Klenow, στο τέλος της αντίδρασης προσθέστε μια υπερβολή της κρύας νουκλεοτίδας της ίδιας νουκλεοτίδας που ονομάζεται (δηλ. εάν χρησιμοποιείτε dCTP32, προσθέστε dCTP στο τέλος) για να σιγουρευτεί όλες τις άκρες γεμίζουν μέσα εξίσου.

Για τα τεμάχια Klenow, 0.3ug φέρνουν το ul μέχρι 100 σε TE, θανάτωση Klenow θερμότητας σε 68 °C για 10 λεπτά.

ΜΑΡΚΑΡΙΣΜΑ με "προεξοχή ένα 5

Δείγμα RXN: 15 NG είναι ανάγκη για κάθε αντίδραση. Εάν κάνοντας τον έλεγχο για πολλές αντιδράσεις να αυξήσει ΑΚΡΙΒΩΣ το ποσό του DNA μέχρι 300 ngs.
15ng: Τεμάχιο DNA
ul 2: 10x Προσωρινός χώρος Κ
ul 5: 32P dCTP 3,33 uM 10 uCi/$l*ul
ul 2: 2mM @ dA, dG dTTP
1 ul: Klenow
τελική ένταση του ήχου 20 ul, 37°C 30 λ..
-- προσθέστε 1 ul 10mM dNTP, 5 ελάχιστο @ 37°C.

-- προσθέστε 80 το ul TE. 68°C 15 λεπτά, που τίθενται στον πάγο.
-- Γ-50 στήλη περιστροφής (περιστροφή για 2000g)
-- ΠΡΟΣΘΕΣΤΕ 1/10 ένταση 3M Na0Ac, 2,5 εντάσεις του ήχου EtOH, πάγος 30 mins, (προαιρετικά εάν [ DNA ] είναι = ή > 3 NG/$l*ul εσείς να ταχυδρομήσει γ-50 άμεσα) Microfuge 30 λεπτά.
-- πλύσιμο με 70%
-- Ξηρός φέρτε επάνω 5ul

Δεσμευτική αντίδραση για footprinting DNase

Η δεσμευτική αντίδραση πρέπει να έχει μεταξύ 10 και 150mM KCl (περισσότερο άλας μειώνει τη δέσμευση αλλά αυξάνει την ιδιομορφία). Η χαρακτηριστική συγκέντρωση είναι 50mM.

Πρωτεϊνικός συσχετισμός DNA:
ul 25 2X του δεσμευτικού προσωρινού χώρου w/o KCl
5ul 3 NG/$l*ul το DNA
Χ ul KCl σε ίσο 10-150 mM KCl
dH20 στον ίσο 50 το ul μείον την ένταση του ήχου για το συσχετισμό
1-3 footprinting μονάδες της δεσμευτικής πρωτεϊ'νης DNA (ή 10 έως 160 ug του ακατέργαστου πυρηνικού αποσπάσματος)

-- μίγμα ήπια, πάγος 10 λεπτά.

ΛΑΒΕΤΕ ΤΟ ΣΥΓΧΡΟΝΙΣΜΟ ΥΠΟΨΗ,
-- ΠΡΟΣΘΕΣΤΕ το ul 50 rt του ασβεστίου/του MG λύσης, 18°C για 1 λεπτό.
-- ΠΡΟΣΘΕΣΤΕ το ul 3 που αραιά RQ1 DNase (0,05 u/ul που αραιώνεται σε Tris) ΕΠΩΑΖΟΥΝ 1 λεπτό.
-- ΣΤΑΜΑΤΗΣΤΕ την προσθήκη 90 με τις λύσεις ΣΤΑΣΕΩΝ 37°C,

-- πρέπει φαινόλη: CIA, και απόσπασμα CIA, και ίζημα αιθανόλης.
-- ΕΠΑΝΑΡΤΗΣΤΕ 4ul της λύσης φόρτωσης.
-- Τρέξτε σε 5% το πρότυπο ουρία-DNA τοποθετώντας διαδοχικά το πήκτωμα (εξετάστε το πήκτωμα σφηνών) με τις παρόδους φόρτωσης appopriate όπως η σκάλα DNA, το άκοπο DNA, και οι έλεγχοι.

Αναλύστε footprinting το πρότυπο.

Ανίχνευση λαθών και προβλήματα; Δείτε το footprinting DNAse φόρουμ!

Για τα προβλήματα και footprinting DNAase ανίχνευσης λαθών, ταχυδρομήστε ένα νέο νήμα για να το συζητήσετε στο footprinting DNA φόρουμ!

Πρωτόκολλα και μέθοδοι άλλα DNA

Οδηγός κλωνοποίησης DNA

Ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων DNA

Η ενζυμική πέψη περιορισμού - όλοι εσείς πρέπει να ξέρεϊ

Πρωτόκολλο απομόνωσης DNA Genomic

Απομόνωση DNA Baceteria

Μετασχηματισμός DNA - περιέχει την ιστορία του DNA

Βρείτε άλλα πρωτόκολλα στον εξωτερικό κατάλογο αρχείων των στοιχείων συμπεριφοράς πρωτοκόλλων DNA μας ή δείτε τα πρωτόκολλα DNA μασ.

Σχετικός:

Πρωτόκολλα DNA Microarray

Pcr πρωτόκολλα

Βιοπληροφορική DNA

Βιοπληροφορική DNA επίσκεψησ.

DNA-SHETJKO'S ειδήσεις

Ειδήσεις DNA