Transfection κυττάρων

Αυτή η transfection περιοχή είναι η πύλη σας για όλα τα πράγματα σχετικά με transfection των κυττάρων με το πλασμίδιο ή το διάνυσμα DNA, του RNA είτε siRNA είτε RNAi, ή ακόμα και της ανασυνδυαζόμενης πρωτεϊ'νης. Παρέχουμε σε σας όλες τις βασικές πληροφορίες, πρωτόκολλα για transfection κυττάρων, βελτιστοποίησης και ανάλυσης τα βήματα, και transfection κυττάρων τις πληροφορίες ανίχνευσης λαθών για να γίνουμε ο τελευταίος εμπειρογνώμονας!

Transfection πίνακας περιεχομένων

• Τι είναι transfection;
• Υπόβαθρο
• Εφαρμογές
• Υλικά
• Transfection μέθοδοι
• Προσωρινοί χώροι
  
• Προετοιμασία
• Πρωτόκολλο
• Αλλα πρωτόκολλαransfection τ
• Θέματα συζήτησης για transfection
• Πάρτε τις οδηγίεσtransfection σας στα προβλήματα
• Ακρες
• Καταχώρηση
• Ανίχνευση λαθών transfection
• Αναφορές

Τι είναι transfection;

Transfection περιγράφει την εισαγωγή του ξένου υλικού στα ευκαριωτικά κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα διάνυσμα ιών ή άλλα μέσα της μεταφοράς.

Transfection όρου για τις μη-προερχόμενες από ιό μεθόδους ο συχνότερα χρησιμοποιείται στην αναφορά στα μαστοφόρα κύτταρα, ενώ ο μετασχηματισμός όρου προτιμάται για να περιγράψει την μη-προερχόμενη από ιό μεταφορά DNA στα βακτηρίδια και τα non-animal ευκαριωτικά κύτταρα όπως οι μύκητες, τα άλγη και οι εγκαταστάσεις.

Transfection των ζωικών κυττάρων περιλαμβάνει χαρακτηριστικά τους παροδικές πόρους ή τις "τρύπεσ" ανοίγματος στη μεμβράνη πλάσματος κυττάρων, για να επιτρέψει τη λήψη του υλικού. Το γενετικό υλικό (όπως πλασμιδίων τα κατασκευάσματα DNA ή siRNA), ή ακόμα και οι πρωτεϊ'νες όπως τα αντισώματα, μπορεί να είναι. Εκτός από τον ηλεκτρομετασχηματισμό, transfection μπορεί να πραγματοποιηθεί με τη μίξη ενός κατιονικού λιπιδίου με το υλικό για να παραγάγει τα λιποσώματα, τα οποία λιώνουν με τη μεμβράνη πλάσματος κυττάρων και καταθέτουν το φορτίο τους μέσα.

Η αρχική έννοια transfection ήταν "μόλυνση από το μετασχηματισμό", δηλ. εισαγωγή του DNA (ή του RNA) από έναν eukaryote ιό ή έναν βακτηριοφάγο στα κύτταρα, με συνέπεια μια μόλυνση. Επειδή ο μετασχηματισμός όρου είχε μια άλλη αίσθηση στη ζωική βιολογία κυττάρων (μια γενετική αλλαγή που επιτρέπει τη μακροπρόθεσμη διάδοση στον πολιτισμό, ή την απόκτηση των ιδιοτήτων χαρακτηριστικών των κυττάρων καρκίνου), transfection όρου που αποκτιέται, για τα ζωικά κύτταρα, η παρούσα έννοιά του μιας αλλαγής στις ιδιότητες κυττάρων που προκαλούνται με την εισαγωγή του DNA.

Transfection είναι μια μέθοδος με την οποία το πειραματικό DNA μπορεί να τεθεί σε ένα καλλιεργημένο μαστοφόρο κύτταρο. Τέτοια πειράματα εκτελούνται συνήθως χρησιμοποιώντας το κλωνοποιημένο DNA που περιέχει τις ακολουθίες κωδικοποίησης και τις περιοχές ελέγχου (γονίδια-υποκινητές, κ.λπ...) προκειμένου να εξετάσουν εάν το DNA θα εκφραστεί. Δεδομένου ότι το κλωνοποιημένο DNA μπορεί να είχε τροποποιηθεί εκτενώς (παραδείγματος χάριν, τις πρωτεϊνικές περιοχές συσχετισμών στο γονίδιο-υποκινητή μπορεί να έχουν αλλάξει ή να είχαν αφαιρεθεί), transfection χρησιμοποιείται συχνά για να εξετάσει εάν μια ιδιαίτερη τροποποίηση έχει επιπτώσεις στη λειτουργία ενός γονιδίου.

Transfection διάγραμμα:

Transfection εφαρμογές

Η δυνατότητα να συντεθεί το RNA στο εργαστήριο είναι κριτική για πολλές τεχνικές. Οι ραδιενεργοί και μη-ραδιενεργοί έλεγχοι RNA απαιτούνται για πολλά πρωτόκολλα, και μπορούν να συντεθούν εύκολα στις μικρής κλίμακας in vitro αντιδράσεις μεταγραφής που επιτρέπουν τη χρήση τους στις υβριδοποιήσεις λεκέδων και τις δοκιμές προστασίας νουκλεάσης.

Απαιτήσεις για transfection;

• Διάνυσμα ή DNA
• Κύτταρα
• Transfection αντιδραστήριο

Βελτιστοποίηση transfection

Η in vitro μεταγραφή απαιτεί ένα καθαρισμένο γραμμικό πρότυπο DNA που περιέχει ένα γονίδιο-υποκινητή, ribonucleotide τριφωσφορικά άλατα, ένα σύστημα προσωρινών χώρων που περιλαμβάνει DTT και το μαγνήσιο

Ποιο transfection αντιδραστήριο στη χρήση;

Η in vitro μεταγραφή απαιτεί ένα καθαρισμένο γραμμικό πρότυπο DNA που περιέχει ένα γονίδιο-υποκινητή, ribonucleotide τριφωσφορικά άλατα, ένα σύστημα προσωρινών χώρων που περιλαμβάνει DTT και το μαγνήσιο

Transfection μέθοδοι

Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι το ξένο DNA σε ένα ευκαριωτικό κύτταρο. Πολλά υλικά έχουν χρησιμοποιηθεί ως μεταφορείς για transfection, το οποίο μπορεί να διαιρεθεί σε τρία είδη: (κατιονικά) πολυμερή σώματα, λιποσώματα και nanoparticles.

Μια από τις φτηνότερες (και λιγότερος αξιόπιστος) μεθόδους είναι transfection από το φωσφορικό άλας ασβεστίου, που ανακαλύπτεται αρχικά από Φ. Λ. Graham και Α. Θ*ι. βαν δερ eb σε 1973[citation που απαιτείται ] (δείτε επίσης [ 1 ]). Η χεπες-αποθηκευμένη αλατούχος λύση (HeBS) που περιέχει τα ιόντα φωσφορικού άλατος συνδυάζεται με μια λύση χλωριδίου ασβεστίου που περιέχει το DNA για να είναι. Όταν τα δύο συνδυάζονται, ένα λεπτό ίζημα του θετικά χρεωμένου ασβεστίου και του αρνητικά χρεωμένου φωσφορικού άλατος θα διαμορφώσει, η δέσμευση του DNA για να είναι στην επιφάνειά της. Η αναστολή του ιζήματος προστίθεται έπειτα στα κύτταρα για να είναι (συνήθως μια κυτταροκαλλιέργεια που αυξάνεται monolayer). Με μια διαδικασία κατανοητή όχι εξ ολοκλήρου, τα κύτταρα λαμβάνουν μερικά από το ίζημα, και με το, το DNA.

Αλλη χρήση μεθόδων διακλαδίστηκε ιδιαίτερα οργανικές ενώσεις, αποκαλούμενα dendrimers, για να δεσμεύσει το DNA και να το πάρει στο κύτταρο. Μια πολύ αποδοτική μέθοδος είναι ο συνυπολογισμός του DNA για να είναι στα λιποσώματα, δηλ. μικροί, μεμβράνη-οριακοί οργανισμοί που είναι με κάποιους τρόπους παρόμοιοι με τη δομή ενός κυττάρου και μπορούν πραγματικά να λιώσουν με τη μεμβράνη κυττάρων, εκδίδοντας το DNA στο κύτταρο. Για τα ευκαριωτικά κύτταρα, βασισμένο στο λιπίδιο-κατιόν transfection χρησιμοποιείται πιό χαρακτηριστικά, επειδή τα κύτταρα είναι πιό ευαίσθητα.

Μια άλλη μέθοδος είναι η χρήση των κατιονικών πολυμερών σωμάτων όπως το δεαε-δεξτραν ή το polyethylenimine. Το αρνητικά χρεωμένο DNA δεσμεύει στο polycation και το συγκρότημα λαμβάνεται από το κύτταρο μέσω του endocytosis.

Μια άμεση προσέγγιση transfection είναι το πυροβόλο όπλο γονιδίων, όπου το DNA συνδέεται με ένα nanoparticle ενός αδρανούς στερεού (συνήθως χρυσού) που έπειτα "πυροβολείται" άμεσα στον πυρήνα του κυττάρου στόχων. Το DNA μπορεί επίσης να εισαχθεί στα κύτταρα χρησιμοποιώντας τους ιούς ως μεταφορέα. Σε τέτοιες περιπτώσεις, η τεχνική καλείται προερχόμενη από ιό μεταγωγή, και, τα κύτταρα θεωρούνται.

Αλλες μέθοδοι transfection περιλαμβάνουν το nucleofection, τον ηλεκτρομετασχηματισμό, τον κλονισμό θερμότητας, το magnetofection και τα ιδιόκτητα transfection αντιδραστήρια όπως Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene ή DreamFect.

Σταύλος εναντίον των παροδικών transfection μεθόδων

Για τις περισσότερες εφαρμογές transfection, είναι ικανοποιητικό εάν το γονίδιο μόνο παροδικά εκφράζεται. Δεδομένου ότι το DNA που εισάγεται στη transfection διαδικασία συνήθως δεν παρεμβάλλεται στο πυρηνικό γονιδίωμα, το ξένο DNA χάνεται στο μεταγενέστερο στάδιο όταν υποβάλλονται τα κύτταρα mitosis. Εάν επιδιώκεται ότι το γονίδιο παραμένει πραγματικά στο γονιδίωμα του κυττάρου και τα θυγατρικά κύτταρά του, σταθερό transfection πρέπει να εμφανιστούν.

Για να ολοκληρώσει αυτό, ένα άλλο γονίδιο πρόκειται ομο-, που δίνει στο κύτταρο κάποιο πλεονέκτημα επιλογής, όπως η αντίσταση προς μια ορισμένη τοξίνη. Μερικά (πολύ λίγοι) από τα κύτταρα, κατά τύχη, θα έχουν παρεμβάλει το ξένο γενετικό υλικό στο γονιδίωμά τους. Εάν η τοξίνη, προς την οποία ομο- το γονίδιο προσφέρει την αντίσταση, προστίθεται έπειτα στην κυτταροκαλλιέργεια, μόνο εκείνα τα λίγα κύτταρα με τα ξένα γονίδια που παρεμβάλλονται στο γονιδίωμά τους θα είναι σε θέση να πολλαπλασιαστούν, ενώ άλλα κύτταρα θα πεθάνουν. Μετά από να εφαρμόσουν αυτήν την πίεση επιλογής για κάποιο χρόνο, μόνο τα κύτταρα με σταθερό transfection παραμένουν και μπορούν να καλλιεργηθούν περαιτέρω.

Ένας κοινός πράκτορας για σταθερό transfection είναι Geneticin, επίσης γνωστό ως G418, το οποίο είναι μια τοξίνη που μπορεί να εξουδετερωθεί από το προϊόν του ανθεκτικού γονιδίου νεομυκίνης.

Ποια transfection αντιδραστήριο ή μέθοδος στη χρήση;

Η in vitro μεταγραφή απαιτεί ένα καθαρισμένο γραμμικό πρότυπο DNA που περιέχει ένα γονίδιο-υποκινητή, ribonucleotide τριφωσφορικά άλατα, ένα σύστημα προσωρινών χώρων που περιλαμβάνει DTT και το μαγνήσιο

Ακρες για transfection

• Ανασταλτικοί παράγοντες χρήσης RNAse πάντα!
• Χρήματα αποταμίευσης με T7 την phage πολυμεράση RNA: Οι κλώνοι με ένα ν-τερματικό του-6 ετικέττα είναι διαθέσιμοι. Εάν λαμβάνετε αυτόν τον κλώνο, μπορείτε να καθαρίσετε τα μεγάλα ποσά T7 πολυμεράσης με την υψηλή δραστηριότητα (REF: αυτός β, Rong μ, Lyakhov δ, Gartenstein χ, Diaz γ, Castagna ρ, McAllister ΒΑΡΟΣ, Durbin RK. Πρωτεϊνικό Expr Purif. 1997 ..9 ..142–151).
• Για να αφαιρέσετε το πρότυπο DNA, χρησιμοποιήστε ένα ρΝΑσε-ελεύθερο DNAse. Έχουμε χρησιμοποιήσει RQ1 DNase (Promega) που προστίθεται για 15 λεπτά και λειτουργεί καλά. 

Καταχώρηση του αντιδραστηρίου Trasfection

• Το RNA καταχωρείται καλύτερα σε ένα ουδέτερο pH με EDTA.
• TE ο προσωρινός χώρος συστήνεται (10 mM τρης- HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA), εντούτοις αυτό πρέπει να προετοιμαστεί με ελεύθερο RNAse που καθαρίζεται (preferablly millipore ύδωρ).

Transfection ανίχνευσης λαθών προβλήματα

Αποτυχημένα transfections

• Παλαιό transfection αντιδραστήριο
• Εσφαλμένα καταχωρημένος transfection πράκτορας
• DNA κακής ποιότητας ή διάνυσμα
• Ανεπαρκές ποσό DNA
• Ανεπαρκές transfection αντιδραστήριο
• Πάρα πολύ DNA
• Πάρα πολύ transfection αντιδραστήριο

Αναφορές transfection

Αναφορές transfection

1. Bacchetti s, Graham F (1977). "Μεταφορά του γονιδίου για την κινάση θυμιδίνης στα κινάση-ανεπαρκή ανθρώπινα κύτταρα θυμιδίνης από το καθαρισμένο μονοκατευθυντικό προερχόμενο από ιό DNA έρπη". Proc natl Acad Sci ΗΠΑ 74 (4): 1590-4. PMID 193108.