Mycoplasma μόλυνση & Κυτταροκαλλιέργεια

Περιλαμβάνουμε εδώ για τα εργαστήρια κυτταροκαλλιέργειας, πληροφορίες για mycoplasma τις μολύνσεις και τις πιό πρόσφατες mycoplasma συζητήσεις φόρουμ για όλες τις ερωτήσεις και τις συζητήσεις μόλυνσής σας.

Mycoplasma υπόβαθρο

Το Mycoplasmas είναι ένα γένος των βακτηριδίων που στερούνται έναν τοίχο κυττάρων. Λόγω σε μια έλλειψη ενός τοίχου κυττάρων, είναι ανθεκτικοί σε πολλά αντιβιοτικά συμπεριλαμβανομένης της πενικιλίνης ή άλλα αντιβιοτικά βήτα-λακτάμης που στοχεύουν στη σύνθεση τοίχων κυττάρων.

Mycoplasma είναι είτε παρασιτικό είτε σαπροφυτικό. Διάφορο mycoplasma ασθένεια-προκαλεί στους ανθρώπους, συμπεριλαμβανομένων των pneumoniae Μ., που είναι μια σημαντική αιτία της άτυπης πνευμονίας και άλλων αναπνευστικών αναταραχών, και του genitalium Μ., το οποίο θεωρείται για να περιληφθεί στις πυελικές εμπρηστικές ασθένειες. Μπορούν να προκαλέσουν ή να συμβάλουν σε μερικούς καρκίνους.

Γένος mycoplasma

Το γένος mycoplasma είναι ένα από διάφορα γένη μέσα στην κλάση Mollicutes. Το Mollicutes είναι βακτηρίδια που έχουν τα μικρά γονιδιώματα, στερούνται έναν τοίχο κυττάρων και έχουν ένα χαμηλό χρωματογραφία-περιεχόμενο (18-40 %).

Υπάρχουν πάνω από 100 αναγνωρισμένα είδη του γένους mycoplasma. Το μέγεθος γονιδιώματός τους κυμαίνεται από 0,58 1,38 μεγαψασε-ζευγάρια. Το Mollicutes είναι παράσιτα ή commensals των ανθρώπων, ζώα (συμπεριλαμβανομένων των εντόμων), και φυτά το γένος mycoplasma είναι εξ ορισμού περιορισμένο στους σπονδυλωτούς ξένιους χ/υ. Η χοληστερόλη απαιτείται για την αύξηση των ειδών του γένους mycoplasma καθώς επίσης και ορισμένα άλλα γένη των mollicutes. Η βέλτιστη θερμοκρασία αύξησής τους είναι συχνά η θερμοκρασία του ξένιου χ/υ τους εάν (π.χ. 37 βαθμοί Κελσίου στους ανθρώπους) ή περιβαλλοντική θερμοκρασία εάν ο ξένιος χ/υ είναι ανίκανος να ρυθμίσει την εσωτερική θερμοκρασία του. Η ανάλυση των ριβοσωματικών ακολουθιών RNA 16S καθώς επίσης και η περιεκτικότητα σε γονίδια έντονα προτείνουν ότι τα mollicutes, συμπεριλαμβανομένων των mycoplasmas, συσχετίζονται πολύ με είτε το γαλακτοβάκιλλο είτε τον κλάδο clostridium του φυλογενετικού δέντρου (stricto sensu Firmicutes).

Γραμμές και Mycoplasmas κυττάρων

Στις κυτταροκαλλιέργειες, τα mycoplasmas μπορούν να προκαλέσουν τις κυψελοειδείς αλλαγές, συμπεριλαμβανομένων των aborations χρωμοσωμάτων, αλλαγές στο μεταβολισμό και την αύξηση κυττάρων. Οι βαριάς μορφής mycoplasma μολύνσεις μπορούν να καταστρέψουν μια γραμμή κυττάρων ή να καταστήσουν τις ακριβές ή πολύτιμες γραμμές κυττάρων άχρηστες.

Μόλυνση κυτταροκαλλιέργειας με mycoplasma

Το Mycoplasmas βρίσκεται συχνά στα ερευνητικά εργαστήρια ως μολυσματικοί παράγοντες στην κυτταροκαλλιέργεια. Η mycoplasmal μόλυνση κυτταροκαλλιέργειας εμφανίζεται λόγω στη μόλυνση από τα άτομα ή τα μολυσμένα μέσα συστατικά κυτταροκαλλιέργειας.

Mycoplasma μέθοδοι ανίχνευσης

Mycoplasma τα κύτταρα είναι συνήθως μικρότερα από 1 ΅m και επομένως αρκετά δύσκολος να ανιχνεύσουν με τις συμβατικές μεθόδους μικροσκόπησης. Οι τεχνικές ανίχνευσης περιλαμβάνουν:

• Pcr
• Σε πραγματικό χρόνο pcr
• Επένδυση στο ευαίσθητο αγάρ
• Λεκέδες DNA συμπεριλαμβανομένου DAPI ή ή του λεκέ Hoescht

Mycoplasma λεκέδων της $*Χοεθχστ πρωτόκολλο ανίχνευσης μόλυνσης

Η $*Χοεθχστ (σίγμα, κατάλογος # :H6024) που λεκιάζει τη μέθοδο για mycoplasma:

1. Για τα προσκολλημένα κύτταρα, τοποθετήστε ένα αποστειρωμένο γυαλί κάλυψης petri στο πιάτο. Προσθέστε 2-3 απελευθερώσεις της αναστολής κυττάρων στη μέση των coverglass (ανάλογα με το ποσοστό αύξησης των κυττάρων σας).
2. Κατόπιν προσθέστε προσεκτικά 2-3 μιλ. του μέσου χωρίς διατάραξη των κυττάρων. Αυξηθείτε τα κύτταρα έως ότου είναι 50 -70% συμβάλλον.

Καθορίζοντας κύτταρα:

1. Προετοιμάστε το στερεωτικό κυττάρων που είναι μια μεθανόλη των FO 3:1 μιγμάτων: παγετώδες οξικό οξύ (M:AA). Σιγουρευτείτε ότι προετοιμάζετε αυτό φρέσκο πριν από τη χρήση.
2. Απορρίψτε το μέσο από την ανάπτυξη των κυττάρων. Προσθέστε 2 μιλ. της μεθανόλης: παγετώδης λύση οξικού οξέος M:AA dropwise επάνω στην πλευρά του πιάτου (όχι άμεσα επάνω στα κύτταρα). Στροβιλιστείτε το πιάτο και απορρίψτε τη λύση.
3. Προσθέστε 2 μιλ. M:AA, στροβιλιστείτε και φύγετε επάνω για 2-3 λεπτά στη θερμοκρασία δωματίου.
4. Απορρίψτε το μ: Λύση και ξέβγαλμα AA με το ύδωρ
5. Η άδεια στον αέρα ξηρό (μπορείτε να κρατήσετε το πιάτο έως ότου είστε αναμένετε για να λεκιάσετε) συγκέντρωση αποθεμάτων λεκέδων Hoecht (γάτα # 33258 από το σίγμα) = 0,1 mg/$l*ml στο ύδωρ που μπορείτε να φιλτραρίσετε αποστειρώνει σε αυτή τη φάση να χρησιμοποιήσει ένα εμπορευματοκιβώτιο περικαλυμμάτων φίλτρων 0.2uM στο κατάστημα φύλλων αλουμινίου αλουμινίου oC στη λύση εργασίας 4 προετοιμάζει φρέσκο κάθε φορά ανάλογα με τις ανάγκες κάνει τη διάλυση 1:1000 (0,1 ΅g/mjl.) του αποθέματος στο ύδωρ

Λέκιασμα των κυττάρων:

1. Προσθέστε αρκετό λεκέ της $*Χοεθχστ για να καλύψετε την ολόκληρη ολίσθηση κάλυψης (χρήση 1- 2ml για ένα μικρό petri πιάτο).
2. Αφήστε το λεκέ επάνω για 45 λεπτά - 1 ώρα (στο σκοτάδι).
3. Ξέβγαλμα καλά με το ύδωρ.
4. Επικολλήστε σε μια φωτογραφική διαφάνεια μικροσκοπίων (mountant μίγμα: mM κιτρικό οξύ 22 mM disodium φωσφορικό άλας 55,6 η γλυκερίνη 50%, το μίγμα pH 5.5) στη θέση μια απελευθέρωση ή δύο στην ολίσθηση κάλυψης (κύτταρα επάνω) και τοποθετούν την ολίσθηση κάλυψης (κύτταρα κάτω) στη φωτογραφική διαφάνεια.
5. Απεικονίστε κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού

Σημείωση: λεκές της $*Χοεθχστ καταστημάτων σε 4oC τουλάχιστον, ή υποπολλαπλάσιο στον ψυκτήρα για τη μακροπρόθεσμη αποθήκευση.