Polyclonal αντισώματα

Όλοι για τα polyclonal αντισώματα.

Το polyclonal αντίσωμα αφορούσε τα εξωτερικά στοιχεία συμπεριφοράς - πρωτόκολλα:

• Δυτικός λεκές
• Immunoblot
• Immunoprecipitation (IP)
• Δημιουργία των αντισωμάτων που χρησιμοποιούν τα πεπτίδια

Επίσης σταθμός αντισωμάτων επίσκεψης για περισσότερους στα polyclonal αντισώματα. Είναι μια νέα περιοχή που οι προμηθευτές αντισωμάτων καταλόγων, μαθαίνουν για τα αντισώματα, και τα πρωτόκολλα.

Polyclonal πρωτόκολλα αντισωμάτων:

• Ανοσοποιώντας ποντίκια
• Προετοιμασία ορών από το αίμα
• Ανοσοποίηση κουνελιών
• Διαδικασία αιμορραγίας κουνελιών
• Λήψη του ορού
• Πτώση θειικού άλατος αμμωνίου IgG από τον ορό
• Ανοσοποίηση
• Πρωτόκολλο ELISA για την polyclonal διαλογή αντισωμάτων

Polyclonal αντίσωμα

Τα polyclonal αντισώματα είναι αντισώματα που προέρχονται από πολλές β-κύτταρα ή γραμμές β-κυττάρων, παρόμοια με το μίγμα αντισωμάτων που βρίσκονται στους ορούς αίματος.

Τα polyclonal αντισώματα είναι επομένως ένα μίγμα πολλών διαφορετικών ιδιομορφιών αντισωμάτων.

Οι polyclonal προετοιμασίες αντισωμάτων που αγοράζονται είναι μίγματα αντισωμάτων πολλών διαφορετικών ιδιομορφιών στο ίδιο αντιγόνο.

Η ανοσοποίηση ενός κουνελιού, του ποντικιού, της αίγας, του κοτόπουλου, ή άλλου ζώου παράγει τα polyclonal αντισώματα. Οι ζωικοί οροί μπορούν να χρησιμοποιηθούν άμεσα, εντούτοις είναι καλύτερο να καθαριστούν τα polyclonal αντισώματα για την εργαστηριακή χρήση.

Polyclonal προετοιμασία αντισωμάτων

Με βάση το πρωτόκολλο από το Δρ Δαβίδ Bowtell

Ανοσοποίηση των ποντικιών:

Οι εγχύσεις για να ανοσοποιήσουν τα ποντίκια για την παραγωγή των polyclonal αντισωμάτων πρέπει να γίνουν σε διαστήματα τουλάχιστον δύο εβδομάδων χώρια.

Οι ακόλουθοι 2 βοηθοί είναι επιτυχείς:

• Βοηθός Freund και βοηθός MPL+TDM (RIBI ImmunoChem έρευνα, Α.Ε.). MPL είναι λιγότερο επικίνδυνο από τον πρώτο βοηθό.

1. Για την πρώτη έγχυση ανοσοποίησης: εγχύσετε 15 - 50 ug εάν αντιγόνο στο βοηθό 200 ul, που εγχέεται υποδόρια.
2. Η δεύτερη έγχυση πρέπει να εμφανιστεί 2 εβδομάδες αργότερα Πρέπει έπειτα να ωθήσετε με 15 - 50 ug του αντιγόνου στο βοηθό. (Εάν οι χρονικές άδειες, ωθούν πάλι μηνιαίως αργότερα).
3. Επτά έως 10 ημέρες αιμορραγούν αργότερα το ποντίκι και τον ορό δοκιμής χρησιμοποιώντας τη δοκιμή που θα χρησιμοποιηθεί για τη διαλογή. Εάν ο τίτλος δεν είναι αρκετά υψηλός, ωθήστε πάλι δύο εβδομάδες μετά από την προηγούμενη ώθηση.

ΚΟΡΥΦΗ

Προετοιμασία ορών:

1. Μετά από να συλλέξει, το αίμα πρέπει να επιτραπεί για να σβολιάσει για 60 λ.. σε 37°C ή O.N σε 4°C.
2. Χωρίστε το θρόμβο από τις πλευρές του σωλήνα (χτύπημα) χρησιμοποιώντας ένα σιφώνιο pasteur. Τοποθετήστε το θρόμβο σε 4°C O.N.
3. Περιστροφή σε 10000 Χ γ για 10 λεπτά σε 4°C για να χωρίσει τον ορό.
4. Ο ορός μπορεί να καταχωρηθεί σε -20°C μετά από να προσθέσει τη γλυκερίνη σε 50%.

Εάν τα μονοκλονικά αντισώματα επιδιώκονται, μόλις έχετε μια "καλή" polyclonal και αξιόπιστη μέθοδο διαλογής να προχωρήσει στο επόμενο βήμα.

ΚΟΡΥΦΗ

Κουνέλια:

Τα κουνέλια είναι ανοσοποιημένα ουσιαστικά όπως περιγράφονται ανωτέρω. Εγχύσεις:

1. Πρώτα στην πλήρη 100-200ug/1ml έγχυση Freund, δύο περιοχές (πέρα από κάθε ώμο).
2. Δεύτερο 1 μήνα αργότερα Freund ΕΛΛΙΠΟΥΣ όπως ανωτέρω.
3. Φλεβοτομία 2 εβδομάδες αργότερα. Ώθηση 2 εβδομάδες αργότερα πάλι (κύκλος 2 + 2 εβδομάδων).

ΚΟΡΥΦΗ

ΠΑΡΑΓΩΓΗ ΤΩΝ POLYCLONAL ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ ΣΤΑ ΚΟΥΝΕΛΙΑ (ΛΕΥΚΌ NEUSEELAND)

Με βάση το πρωτόκολλο από το Δρ walter Steffen.

Τα κουνέλια πρέπει να είναι 3-4 κλ σε βάρος και περίπου 3 μηνών. Ένα περίπου τρίτο του κουνελιού έχει τα ενδογενή αντισώματα και το immunoactivity αντι-κερατινών για τα διάφορα άλλα κυψελοειδή συστατικά. Αυτό υπογραμμίζει τη σημασία τον προ-άνοσο ορό από οποιοδήποτε δεδομένο κουνέλι.

Προσωρινοί χώροι και λύσεις:

• Διαποτισμένη λύση θειικού άλατος αμμωνίου, 2 mM EDTA, pH 8,0
• 50 mM οξικό άλας αμμωνίου, pH 8,0
• αιθανόλη 70%
• Βοηθός Freund (πλήρης & ελλιπής)
• Αποθηκευμένος φωσφορικό άλας αλατούχος (PBS) (δείτε κατωτέρω)
• Βαζελίνη
• Ξυλόλιο

ΚΟΡΥΦΗ

• Φέρτε το κουνέλι από το κλουβί του και το τοποθετήστε ασφαλώς σε ένα σταματώντας πεδίο που αφήνει το αυτί προσιτό. Κρατήστε την ηρεμία κουνελιών σχετικά. Οι εντάσεις του ήχου του αίματος μέχρι 50 μιλ. μπορούν εύκολα να συλλεχθούν από τη βασική αρτηρία που μειώνει το κέντρο της ραχιαίας επιφάνειας του αυτιού.
• Το ξύρισμα άφησε το αυτί γύρω από την αριστερή φλέβα με μια φρέσκια λεπίδα ξυραφιών.
• Σφουγγαρίστε το αυτί με την αιθανόλη ή isopropanol 70%.
• Σφουγγαρίστε το αυτί με το ξυλόλιο γύρω από το βρόχο αρτηρία-φλεβών που διαστέλλει.
• Κρατήστε την άκρη του αυτιού (σταθερά) και το σωλήνα συλλογής σε ένα χέρι και με το ελεύθερο ένθετο χεριών μια υποδερμική βελόνα 19G στη διεσταλμένη αρτηρία. Το αίμα πρέπει να αρχίσει να ρέει αμέσως στο σωλήνα συλλογής. Για το καλύτερο τα αποτελέσματα χρησιμοποιούν μια μερίδα της αρτηρίας ευρισκόμενη στη μέση του δρόμου κατά μήκος του αυτιού.
• Συλλέξτε μέχρι 50 μιλ. αίματος. Εφαρμόστε την πίεση ακριβώς προηγούμενη στο σημείο εισόδου της βελόνας να σταματήσετε.
• Εφαρμόστε τη βαζελίνη στο αυτί στην ενόχληση ξυλολίων soothe.
• Βάλτε την πρόσθετη βαζελίνη στην αποκοπή.

Λήψη του ορού:

ΚΟΡΥΦΗ

• Σωλήνας στροβίλου με το συλλεχθέν αίμα για να ντύσει την επιφάνεια και για να αποτρέψει τη σύνδεση θρόμβων στο σωλήνα.
• Επωάστε σε 37 oC για 1 ώρα.
• Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση σε 2.500 γ (τιμή τών παραμέτρων #7 σε μια κλινική επιτραπέζια κορυφή) για 10 λ..
• Αφαιρέστε το θρόμβο και τον ορό περιστροφής σε 3.000 γ για 10 λ..
• Ο ορός πρέπει να καταχωρηθεί παγωμένος.

Πτώση θειικού άλατος αμμωνίου IgG από τον ορό (4 oC, που πραγματοποιείται στο κρύο δωμάτιο):

Η πτώση θειικού άλατος αμμωνίου είναι μια εύκολη μέθοδος για να λάβει ένα αρκετά καθαρό μέρος IgG.

ΚΟΡΥΦΗ

• Ορός λιμνών από ένα κουνέλι
• Ορός βάρους
W1 = _____ γ
• Οι σωλήνες πλυσίματος με ελάχιστο PBS και ζυγίζουν πάλι.
W2 = _____ γ
• Προσθέστε την 2/3 ένταση του ήχου W2 του διαποτισμένου θειικού άλατος αμμωνίου, 2 mM EDTA, pH 8,0
Σημείωση: προσθέστε πολύ αργά, dropwise ανακατώνοντας σε 4 oC ή χρησιμοποιήστε την περισταλτική αντλία.
• Ανακατώστε για 15 λ..
• Μεταφορά στους σωλήνες φυγοκεντρωτών 40 μιλ. κούπα πλυσίματος με 3 μέρη PBS: το θειικό άλας αμμωνίου 2 μερών και προσθέτει στους σωλήνες.
• Περιστροφή σε 12.000 γ (Beckman ια-20: 10.000 περιστροφές/λεπτό) για 10 λ..
• Απορρίψτε το υπερκείμενο νερό.
• Επαναρτήστε το σβόλο σε PBS [ 1/2 W1 = 1/2 ένταση. ].
• Η περιστροφή σε 12.000 γ για 10 λ., απορρίπτει το σβόλο.
• Συλλέξτε το υπερκείμενο νερό στην κούπα, τοίχοι πλυσίματος με PBS.
Καθορίστε W3 = _____
• Προσθέστε το 2/3 διαποτισμένο θειικό άλας αμμωνίου τόμων W3, ανακατώνοντας. Συνεχίστε για 15 λ..
• Μεταφέρετε την αναστολή στους σωλήνες φυγοκεντρωτών 40 μιλ., σωλήνας πλυσίματος με PBS/ly'si θειικού άλατος αμμωνίου.
• Περιστροφή σε 12.000 γ για 10 λ..
• Απορρίψτε το υπερκείμενο νερό.
• Επαναρτήστε τους σβόλους σε 1/4 W1 PBS.
• Διαλύστε ενάντια σε PBS, 3-χρόνοι 6 ώρες κάθε μια.
• Βάλτε τον ορό σε έναν κλιμακωτό σωλήνα, τσάντα διάλυσης ξεβγαλμάτων καλά με PBS.
• Φέρτε το μέχρι 1/2 W1 = 1/2 ένταση σε PBS.
• Καθορίστε την πρωτεϊνικά συγκέντρωση και το υποπολλαπλάσιο για την αποθήκευση. Μετρήστε την απορρόφηση σε 280 NM. Η απορρόφηση 1 mg/$l*ml λύση IgG είναι περίπου 1,5.

Ανοσοποίηση:

ΚΟΡΥΦΗ

• Διαλύστε το αντιγόνο ~400-600 γ (~200-300 γ ανά έγχυση) σε 2,2 50 mM μιλ. οξικού άλατος αμμωνίου, προσωρινός χώρος pH 8,0 ή άλλο κατάλληλος. Η συγκέντρωση εξαρτάται από antigenicity της πρωτεϊ'νης που εγχέεται.
• Το ποσό αντιγόνου που απαιτείται για να ανοσοποιήσει ένα ζώο εξαρτάται από τον antigenicity και η μέθοδος ανοσοποίησης. Εάν οι πρωτεϊ'νες με χαμηλό antigenicity χρησιμοποιούνται, θα είναι χρήσιμο να μετουσιωθεί η πρωτεϊ'νη με μια χαμηλή συγκέντρωση SDS (μέχρι 0.2%). Μόνο το ιδιαίτερα καθαρισμένο αντιγόνο πρέπει να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή των polyclonal αντισωμάτων. Μια εύκολη μέθοδος για να λάβει ένα καθαρό αντιγόνο είναι από SDS-PAGE. Τις πρωτεϊ'νες μπορούν να μεταφερθούν σε ένα φύλλο nitrocellulose, να λεκιάσουν με Ponceau s, να αποκοπούν με μια λεπίδα ξυραφιών, και να χρησιμοποιηθούν ως αντιγόνο (ψάξτε τα πρότυπα πρωτόκολλα στην σδς-ΣΕΛΊΔΑ).
• Καταρτίστε τον πλήρη βοηθό 1.1.ml Freund με ένα 20G που η υποδερμική βελόνα, κατόπιν καταρτίζει 1,1 μιλ. της λύσης αντιγόνων. Παγώστε την παραμονή 1,1 μιλ. για την ώθηση.
• Κρατώντας το δύτη ακίνητο, αφαιρέστε τη βελόνα και συνδέστε μια αποστειρωμένη 3-way στρόφιγγα.
• Αναμίξτε το αντιγόνο με το βοηθό με την ένωση μιας δεύτερης σύριγγας γυαλιού με τη στρόφιγγα και την έγχυση πέρα δώθε. (Προσοχή: μερικές πλαστικές σύριγγες να αντιδράσουν με το ορυκτέλαιο.)
• Ένα πλήρες γαλάκτωμα θα διαμορφωθεί μετά από περίπου 20-30 λ. υποδειγμένος από μια μάλλον ξαφνική αύξηση στο ιξώδες της λύσης.

Προσοχή: να είστε βέβαιος ότι το μοντάρισμα είναι ασφαλές!
• Μετά από να αναμίξει περιμένετε περίπου 20 λ. πριν από την έγχυση που ελέγχει ότι το μίγμα είναι πλήρες (εάν ελλιπές, πετρέλαιο θα χωρίσει).
• Ξυρίστε πίσω του κουνελιού από τις λεπίδες ώμων στη λεκάνη.
• Καθαρίστε πίσω με την αιθανόλη ή isopropanol 70%
• Εγχύσετε κάτω από το δέρμα σε περίπου 10-20 πλευρές κατά μήκος της σπονδυλικής στήλης μεταξύ της λεπίδας ώμων και της λεκάνης χρησιμοποιώντας μια υποδερμική βελόνα 21G. (Σημείωση: πρώτα έγχυση μια εβδομάδα μετά από το τελευταίο preimmune που αιμορραγεί).
• Περιμένετε έναν μήνα και ωθήστε με ένα μίγμα αντιγόνου και ελλιπούς βοηθού. Αποφύγετε τα σημάδια από την προηγούμενη έγχυση.
• Φλεβοτομία μετά από μια εβδομάδα για να ελέγξει για την άνοσος-απάντηση. Η ώθηση πρέπει να επαναληφθεί, εάν η άνοση απάντηση ήταν πάρα πολύ αδύνατη εντούτοις, ένα διαφορετικό κουνέλι πρέπει να επιλεχτεί, εάν το κουνέλι δεν αντέδρασε καθόλου όλοι. / Λι >

Αναφορές: Garvey, J.S., Cremer, Β.Α., & Sussdorf, D.H. (1977) σε: Μέθοδοι στην ανοσολογία. Μπαρ. Ο Benjamin/$l*Cummings Publishing Company. Μάζα αναγνώσεων. PP 545

Διαλογή του polyclonal αντισώματος που χρησιμοποιεί τη δοκιμή ELISA

Πρωτόκολλο ELISA για την οθόνη αντισωμάτων:

Υλικά για ELISA:

° πιάτα - 96 καλά Dynatech Immulon, τύπος 2. (ψαράς 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + tween 20 ή TBS 0,1% + tween 20 0,1%.

° λύση φραξίματος = 2% BSA (τύπος Β) σε PBS. (Προσθέστε το αζίδιο 0,02% για την πιό μακροχρόνια αποθήκευση.)

Προσωρινός χώρος ° Elisa = 2% BSA + tween 20 0,1% σε PBS (αζίδιο προαιρετικό).

° συνδεμένο ένζυμο αντίσωμα = peroxidase 1 χρένου

° υπόστρωμα = ABTS - 100X (από Zymed 00-2001)1

Προσωρινός χώρος ° HRP: κιτρικό άλας pH NA 100mM 4.2($l*490 mg κιτρικού οξέος + 720 mg κιτρικού άλατος NA

dihydrate + 50 μιλ. H2O, pH 4,2).

° υπεροξείδιο υδρογόνου 30% (1000X)

ΚΟΡΥΦΗ

Πρωτόκολλο ELISA για το polyclonal αντίσωμα

1) ADSORBTION ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΌΝΟΥ

α) Αραιός άργυρος 10 ug/mjl. σε PBS.

β) Προσθέστε το ul 100 της λύσης άργυρου σε κάθε μια καλά.

γ) Αφήστε O.N καλυμμένο με saran το περικάλυμμα, σε 4°C.

2) ΦΡΑΞΙΜΟ

α) Αποδεσμευμένος ο πλύσιμο άργυρος με την αναστροφή των πιάτων και το τίναγμα των φρεατίων ξεραίνει.

β) Ξέβγαλμα με να προσθέσει PBS σε κάθε ένα καλά και να αναστρέψει το πάλι (μπουκάλι χρήσης squirt).

γ) Επαναλάβετε το ξέβγαλμα δύο φορές.

Δ) Προσθέστε το ul 100 να εμποδίσει τη λύση στο κάθε καλά, αφήστε 1 ωρ. temp δωματίων ή O.N σε 4°C.

3) ΑΡΧΙΚΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑ

α) Προσθέστε το αντίσωμα που εξετάζεται:

Γουλιά των κυττάρων = 25 ul, μίγμα καλά με πάνω-κάτω (10 φορές).

ορός, ασκήτες = 1:100 και ένα serie του 1/5 διαλύσεων. Κάνετε τις διαλύσεις στο φράξιμο της λύσης.

β) Αφήστε 1 ωρ. temp δωματίων ή O.N σε 4°C.

4) ΔΕΥΤΕΡΟΒΑΘΜΙΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑ

α) Αποδεσμευμένο πλύσιμο αντίσωμα 4 φορές με PBS + tween 20 0,1%.

β) Προσθέστε το ul 100 συνδεμένου του ένζυμο αντισώματος σε όλα τα φρεάτια. Κάνετε τις κατάλληλες διαλύσεις στον προσωρινό χώρο Elisa. (πρώην: HRP είναι 2000X).

γ) Αφήστε 1 ωρ. temp δωματίων ή O.N σε 4°C.

5) ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ

α) Υπόστρωμα Disolve στο ύδωρ.

β) Πιάτο πλυσίματος 4 φορές με PBS + tween 20 0,1% (χρήση TBS αντί PBS για το AP).

γ) Προσθέστε το ul 100 του υποστρώματος στο κάθε καλά.

Δ) Προσέξτε την ανάπτυξη χρώματος. Αυτό θα μπορούσε να πάρει από μερικά δευτερόλεπτα σε 20 λ..

ε) Εάν είναι απαραίτητο, σταματήστε την αντίδραση με την προσθήκη του ul 50 4M NaOH.

φ) Διαβάστε την απορρόφηση στον αναγνώστη Elisa στο σωστό μήκος κύματος (για το σύστημα HRP 416 NM, για το AP - 405 NM).

ΚΟΡΥΦΗ

Αλλοι ιστοχώροι αντισωμάτων

Δείτε το σταθμό αντισωμάτων είναι μια νέα περιοχή που καλύπτει τα αντισώματα, τους προμηθευτές αντισωμάτων, και άλλες αντίσωμα-σχετικές με την πληροφορίες.

Βρείτε άλλα αντίσωμα και σχετικά μονοκλονικά θέματα αντισωμάτων εδώ: