Die Lösung der analysiert zu werden Proteine wird zuerst mit SDS, ein anionisches Reinigungsmittel gemischt, das die Sekundär- und nicht-Disulfid-gebundenen tertiären Strukturen denaturiert, und eine negative Ladung an jedem Protein im Verhältnis zu seinem Mass. anwendet. Ohne SDS würden verschiedene Proteine mit ähnlichen Molekulargewicht anders als wegen der Unterschiede migrieren, bezüglich sich zu falten, da Unterschiede bezüglich der faltenden Muster etwas Proteine veranlassen würden, Sitz durch die Gelmatrix als andere zu verbessern. Das Hinzufügen von SDS löst dieses Problem, da es die Proteine linearisiert, damit sie durch Molekulargewicht (Primärstruktur oder Zahl (und Größe) ausschließlich getrennt werden können der Aminosäuren). Der SDS bindet an das Protein in einem Verhältnis von ungefähr 1.4 g SDS pro 1.0 g das Protein (obgleich verbindliche Verhältnisse 1.1-2.2 Protein vom g-SDS/g schwanken können) und gibt eine ungefähr konstante Masse: laden Sie Verhältnis für die meisten Proteine auf, damit der Abstand der Systemumstellung durch das Gel angenommen werden kann, mit nur der Größe des Proteins direkt zusammenzuhängen. Eine aufspürenfärbung kann der Proteinlösung hinzugefügt werden, um dem Experimentator zu erlauben, den Fortschritt der Proteinlösung durch das Gel während des elektrophoretischen Durchlaufes aufzuspüren.
Chemische Bestandteile und seine Rollen
'' Polyacrylamidgel (PAG) '' bekannt als möglicher einbettenmedium für die Einteilung der Gewebe schon in 1954. Zwei unabhängige Gruppen Davis und Raymond setzten PAG in der Elektrophorese 1959 ein. Sie besitzt einige elektrophoretisch wünschenswerte Merkmale, die es einen vielseitig begabten Medium bildeten. Polyacrylamidgel trennt Proteinmoleküle entsprechend Größe und Ladung. Es ist ein synthetisches Gel, hitzebeständig, transparent, stark, verhältnismäßig chemisch träge, kann mit einer großen Auswahl der durchschnittlichen Poregrößen vorbereitet werden, kann den Hochspannungssteigungen widerstehen, die zu den verschiedenen befleckenden und destaining Prozeduren durchführbar sind und kann verdaut werden, um getrennte Brüche zu extrahieren oder für Autoradiografie und permanente Aufnahme getrocknet werden. PLATTEN-Elektrophorese verwendet Gele der verschiedenen Poregrößen. Die Namens-PLATTE wurde von den Unstimmigkeiten in der elektrophoretischen Matrix und übereinstimmend von der scheibenförmigen Form der getrennten Zonen der Ionen (Anbalagan, 1999) berechnet. Es gibt zwei Schichten des Gels, nämlich stapeln oder Distanzscheibengel und löst oder trennt Gel.
Stapeln des Gels
Das stapelnde Gel ist ein großes Porepolyacrylamidgel (4%). Dieses Gel wird mit Tris Buffer pH 6.8 von ungefähr 2 pH-Maßeinheiten niedriger als die des Elektrophoresebuffers vorbereitet. Diese Bedingungen stellen eine Umgebung für Kohlrausch Reaktionen zur Verfügung, infolgedessen werden Proteine zu einigen Falte und eine dünne beginnende Zone der Ordnung von 19 konzentriert? m wird in einigen Minuten erzielt. Dieses Gel wird über dem lösenden Gel geworfen. Die Höhe der stapelnden Gelregion war immer die aufrechterhaltene mehr als doppelte Höhe und der Datenträger der angewendet zu werden Probe.
Lösendes Gel
Das lösende Gel ist ein kleines Porepolyacrylamidgel (3 30%). Der benutzte Tris Buffer ist von pH 8.8. In diesem Gel trennen sich Makromoleküle entsprechend ihrer Größe. Im anwesenden Experiment 8%, 10% und 12% wurden das lösende Gel für das Trennen der unterschiedlichen Strecke der Proteine benutzt. 8% Gel für 24 †„205 kD Proteine, 10% Gel für 14-205 kD Proteine und 12% Gel für 14-66 kD Proteine
Chemische Bestandteile
Tris (tris (Hydroxyl- Methyl) aminomethane) (C4H11NO3; mw: 121.14). Er ist als Buffer verwendet worden, weil es eine harmlose Substanz zu den meisten Proteinen ist. Sein pKa ist 8.3 bei 20 °C und angemessen einem sehr zufrieden stellenden Buffer im pH-Strecke 7.0 †„9.0.
Glycin (Aminoessigsäure) (C2H5NO2; mw: 75.07). Glycin ist als die Quelle des schleppenden Ions oder des langsamen Ions benutzt worden, weil sein pKa 9.69 ist und Mobilität von glycinate so ist, dass die wirkungsvolle Mobilität an einem Wert unter der der langsamsten bekannten Proteine der negativen Nettoladung in der pH-Strecke eingestellt werden kann. Das Minimum pH dieser Strecke ist irgendwo herum 8.0.
Acrylamid (C3H5NO; mw: 71.08). Es ist ein weißes kristallenes Puder. Bei der Auflösung im Wasser, findet autopolymerisation des Acrylamids statt. Es ist ein langsamer spontaner Prozess, durch den Acrylamidmoleküle zusammen durch Kopf auf Endstückart und weise verbinden. Aber im Vorhandensein der freien Radikale, die System festlegen, sind Acrylamidmonomeren in einen frei-radikalen Zustand aktiviert. Diese aktivierten Monomeren polymerisieren schnell und bilden langkettige Polymer-Plastiken. Diese Art der Reaktion bekannt als Vinylzusatzpolymerisierung. Eine Lösung dieser Plastikketten wird, zähflüssig aber bildet nicht ein Gel, weil die Ketten einfach über gegenseitig schieben. Gelanordnung benötigt verschiedene Ketten zusammen anspannen. Acrylamid ist ein Neurotoxin. Es ist auch wesentlich, Acrylamid in einem kühlen dunklen und trockenen Platz zu speichern, um autopolymerisation und Hydrolyse zu verringern.
Bisacrylamide (N, N’-Methylenebisacrylamide) (C7H10N2O2; mw: 154.17). Bisacrylamide vertritt sehr häufig benutzte QuerbindenPolyacrylamidgele. Chemisch wird es an Haben der Zweiacrylamid Moleküle verband Kopf-an-Kopf- an ihren phasenfreien Enden gedacht. Bisacrylamide wurde bei 4 °C. konserviert.
Natriumdodecylsulfat (SDS) (C12H25NaO4S; mw: 288.38). SDS ist das geläufigste trennenmittel, das benutzt wird, um gebürtige Proteine zu den einzelnen Polypeptiden zu denaturieren. Wenn eine Proteinmischung zu 100 °C im Vorhandensein von SDS erhitzt wird, die Reinigungsmittelverpackungen um das Polypeptidrückgrat. Sie bindet an Polypeptide in einem Verhältnis des konstanten Gewichts von 1.4 g/g des Polypeptids. In diesem Prozess wird die tatsächlichen Ladungen der Polypeptide, wenn sie mit den negativen Ladungen verglichen werden, beitrugen durch SDS unwesentlich. So Polypeptide, nachdem Behandlung eine Stange wie die Struktur wird, die eine konstante Ladungdichte besitzt, das ist die gleiche negative Nettoladung pro Maßeinheitslänge. Mobilität dieser Proteine ist eine lineare Funktion der Logarithmen ihrer Molekulargewicht.
Ammoniumpersulphat (APS) (N2H8S2O8; mw: 228.2). APS ist ein Initiator für Gelanordnung.
TEMED (N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine) (C6H16N2; mw: 116.21). Chemische Polymerisierung des Acrylamidgels wird für SDS-PAGE verwendet. Sie kann durch Ammoniumpersulphat und das quaternäre Amin, N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) initialisiert werden. Die Kinetik der Polymerisierung und der Eigenschaften des resultierenden Gels hängt von der Konzentration von APS und von TEMED ab. Die Erhöhung der Menge von APS und von TEMED ergibt eine Abnahme an der Kettenlänge des durchschnittlichen Polymer-Plastiks, eine Zunahme der Geltrübung und eine Abnahme an der Gelelastizität. Die Verringerung der Menge der Initiator zeigt den Rückeffekt. Die niedrigsten Katalysatorkonzentrationen, die Polymerisierung im optimalen Zeitabschnitt erlauben, sollten verwendet werden. APS und TEMED werden, ungefähr in den Equimolar- Konzentrationen in der Strecke 1 bis 10 Millimeters verwendet.
Chemikalien für die Verarbeitung und Sichtbarmachung
Die folgenden Chemikalien werden für die Verarbeitung des Gels und der Proteinproben benutzt, die in ihm sichtbar gemacht werden:
Bromophenol-Blau (BPB) (3’, 3’’, 5’, 5’’-Tetrabromophenolsulphonephthalein) (C19H10Br4O5S; mw: 669.99). BPB ist die Universalmarkierungsfärbung. Proteine und Nukleinsäuren sind meistens farblos. Wenn sie Elektrophorese unterworfen werden, ist es wichtig, den Durchlauf zu stoppen, bevor sie das Gel deaktivieren. BPB ist am geläufigsten eingesetzt, Färbung aufspürend, weil es im Alkali und in Nullph entwicklungsfähig ist, es, ist ein kleines Molekül, ist es ionisierbar und es ist negativ - aufgeladen über pH 4.6 und bewegt folglich sich in Richtung zur Kathode. Ein kleines Molekül sein es bewegt sich vor den meisten Proteinen und den Nukleinsäuren. Während es erreicht, wird das aufsteigende Ende der mittleren Elektrophorese der Elektrophorese gestoppt. Es kann mit Proteinen schwach binden und blaue Farbe geben.
Glyzerin (C3H8O3; mw: 92.09). Es ist ein Konservierungsmittel und ein wiegendes Mittel. Zusatz des Glyzerins (20-30 oder 50%) wird häufig für die Speicherung der Enzyme empfohlen. Glyzerin behält die Proteinlösung bei der sehr niedrigen Temperatur bei, ohne einzufrieren. Es hilft auch, die Probe in die Vertiefungen unten zu wiegen, ohne beim Laden verbreitet zu werden.
Coomassie leuchtendes Blau (CBB) (C45H44N3NaO7S2; mw: 825.97). CBB ist der populärste Proteinfleck. Es ist eine anionische Färbung, die mit Proteinen unspezifisch bindet. Die Struktur von CBB ist überwiegend apolar. So wird normalerweise (0.025%) in der Methanol- Lösung (40%) und in der Essigsäure (7%) verwendet. Proteine im Gel werden durch Essigsäure geregelt und befleckt gleichzeitig. Die überschüssige Färbung, die im Gel enthalten wird, kann durch das Destaining mit der gleichen Lösung aber ohne die Färbung gelöscht werden. Die Proteine werden als blaue Bänder auf einem freien Hintergrund entdeckt. Da SDS auch anionisch ist, kann es das Beflecken des Prozesses behindern. Folglich umfangreich vom Beflecken der Lösung wird, ungefähr 10mal der Datenträger des Gels empfohlen.
Butanol- (C4H10O; mw: 74.12). Wasser gesättigtes Butanol- wird wie eine Testblattlösung auf dem lösenden Gel verwendet.
Außer der Einführung von SDS, können Proteine zum nahen Kochen in Anwesenheit eines Reduktionsmittels, wie dithiothreitol (DTT) oder 2-mercaptoethanol (beta-mercaptoethanol/BME, das die Proteine, indem es weiter Disulfiddenaturiert Gestänge verringert, so überwindt einige Formulare der tertiären Proteinfalte, und oben bricht quaternäre Proteinstruktur (Oligomere Untereinheiten) beliebig kurz erhitzt werden. Dieses bekannt als Verringerung von SDS-PAGE, und ist allgemein am verwendetsten. Nicht reduzierbares SDS-PAGE (kein kochendes und kein Reduktionsmittel) kann verwendet werden, wenn gebürtige Struktur in der weiteren Analyse wichtig ist (z.B. die Enzymaktivität, gezeigt unter Anwendung von zymograms). Z.B. ist quantitative vorbereitende gebürtige kontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (QPNC-PAGE) eine neue Methode für das Trennen der gebürtigen metalloproteins in den komplizierten biologischen Matrizen.
Zwei SDS-SEITE-Gele nach einem abgeschlossenen Durchlauf
Die denaturierten Proteine werden nachher an einem Ende einer Schicht des Polyacrylamidgels versenkt in einen verwendbaren Buffer angewendet. Ein elektrischer Strom ist über dem Gel angewandt und veranlaßt die negatively-charged Proteine, über das Gel in Richtung zur Anode zu migrieren. Abhängig von ihrer Größe bewegt sich jedes Protein anders als durch die Gelmatrix: kurze Proteine willen leicht gepasst durch die Poren im Gel, wenn groß eine, haben mehr Schwierigkeit (sie treffen mehr Widerstand an). Nach einer Setzeitmenge (normalerweise einig hängt hoursthough dieses von der Spannung ab, die über dem Gel angewendet wird; höhere Spannungen laufen, schneller aber neigen, ein wenig schlechtere Auflösung zu produzieren), die Proteine haben migriert differenzial gegründet auf ihrer Größe; kleinere Proteine haben gereisten weiteren Abstieg das Gel, wenn groß eine, sind geblieben näeher an dem Abgangsort. So können Proteine entsprechend Größe (und folglich, Molekulargewicht) ungefähr getrennt werden. Nach Elektrophorese kann das Gel befleckt werden (am geläufigsten mit Coomassie leuchtendem blauem oder silbernem Fleck) und Sichtbarmachung der getrennten Proteine erlauben, oder weiter verarbeitet werden (z.B. westlicher Fleck). Nachdem sie befleckt haben erscheinen verschiedene Proteine als eindeutige Bänder innerhalb des Gels. Es ist für Durchlauf „Markierungsproteine“ des bekannten Molekulargewichtes in einem unterschiedlichen Weg im Gel geläufig, um das Gel zu kalibrieren und das Gewicht der unbekannten Proteine, indem sie den Abstand, festzustellen verglich reiste im Verhältnis zu der Markierung. Dem Gel wird wirklich, weil die Acrylamidlösung eine kleine Menge enthält, im Allgemeinen ungefähr 1 Teil in 35 von bisacrylamide gebildet, das Querverbindungen zwischen zwei Polyacrylamidmolekülen bilden kann. Das Verhältnis des Acrylamids zum bisacrylamide kann zu den speziellen Zwecken unterschieden werden. Die Acrylamidkonzentration des Gels kann, im Allgemeinen in die Strecke von 5% bis 25% auch unterschieden werden. Unterere Prozentsatzgele sind für Molekulargewichtproteine sehr lösen besser, während viel höhere Prozentsätze erforderlich sind, kleinere Proteine zu lösen. Bestimmung, wie viel der verschiedenen Lösungen, zusammen zu mischen, um Gele von der bestimmten Acrylamidkonzentration zu bilden auf Zeile getan werden kann
Gelelektrophorese ist normalerweise die erste Wahl als Probe der Proteinreinheit wegen seiner Zuverlässigkeit und Mühelosigkeit. Das Vorhandensein von SDS und von denaturierenjobstep veranlaßt Proteine, nur getrennt zu werden gründete auf Größe. Falsche Negative und Positive sind möglich. Ein Co-Migrierenverschmutzer kann als das gleiche Band wie das gewünschte Protein erscheinen. Dieses comigration konnte ein Protein auch veranlassen, in einer verschiedenen Position zu laufen oder nicht in der Lage zu sein, das Gel einzudringen. Deshalb ist es wichtig, das gesamte Gel einschließlich das stapelnde Kapitel zu beflecken. Coomassie leuchtendes Blau bindet auch mit weniger Affinität an Glucoproteide und faserartige Proteine, die Quantifikation (Deutscher 1990) behindert.
Buffersysteme
Die meisten Proteintrennungen werden unter Verwendung eines „unterbrochenen“ Buffersystems durchgeführt, das erheblich die Schärfe der Bänder innerhalb des Gels erhöht. Während der Elektrophorese in einem unterbrochenen Gelsystem, wird eine Ionensteigung im Anfangsstadium von Elektrophorese gebildet, die alle Proteine veranlaßt, in ein einzelnes scharfes Band zu fokussieren. Dieses tritt in einer Region des Gels auf, das größere Poren hat, damit die Gelmatrix die Systemumstellung nicht während der Fokussierung oder „des Stapelns“ des Ereignisses verzögert. Negative Ionen vom Buffer im Behälter dann „holen“ das SDS-bedeckte Protein „Stapel“ über und beseitigen die Ionensteigung, damit die Proteine sich nachher durch die siebende Tätigkeit im niedrigeren trennen, „lösende“ Region des Gels.
Viele Leute fahren fort, ein Trisglycin oder „Laemmli“ Pufferbetriebssystem zu benutzen, das bei einem pH von ~8.3-9.0 stapelt und löst. Diese pHs fördern Disulfidbindunganordnung zwischen Cysteinrückständen in den Proteinen, besonders wenn sie bei hohen Konzentrationen anwesend sind, weil das pKa des Cysteins von 8-9 reicht und weil das Reduktionsmittel, das im Ladenbuffer anwesend ist, nicht mit den Proteinen Co-migriert. Neue Fortschritte in der Pufferbetriebstechnologie vermindern dieses Problem, indem sie gut die Proteine bei einem pH unter dem pKa des Cysteins (z.B., BIS-tris, pH 6.5) lösen und umfassen Reduktionsmittel (z.B. Natriumbisulfit) diese Bewegung in das Gel vor den Proteinen, eine reduzierende Umgebung zu erhalten. Ein zusätzlicher Nutzen der Anwendung der Buffer mit untereren pHs ist, dass das Acrylamidgel beständiger ist, also die Gele für lange Zeitspannen der Zeit vor Gebrauch gespeichert werden können.
„Das silberne Beflecken der Proteine auf electroblotting Membranen und Intensivierung des silbernen Befleckens der Proteine trennte sich durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese anale Biochemie 2002“.
„Tricine-Natriumdodecylc$sulfatpolyacrylamid Gelelektrophorese für die Trennung der Proteine in der Strecke von 1 bis 100 kDa anale Biochemien 1987“.
„Spaltung der strukturellen Proteine während des Zusammenbaus des Kopfes von Bakteriophage T4 Natur 1970“.
