Schablone: Adressieren SiePolymerase, die um Kettenreaktion (PCR) eine Technik der Biochemie und der Molekularbiologie[1] für DNAenzymatischwiederholen ist, ohne einen lebenden Organismus zu verwenden, wie Escherichia Coli oder Hefe. Wie Verstärkung unter Verwendung der lebenden Organismen, erlaubt die Technik, dass eine kleine Menge DNA exponential verstärkt wird. Da PCR eine in-vitrotechnik ist, kann es ohne Beschränkungen auf dem Formular von DNA durchgeführt werden, und es kann weitgehend geändert werden, um eine große Auswahl genetische Handhabungen durchzuführen.
PCR wurde von Kary Mullis erfunden. Zu der Zeit als er herauf PCR 1983 dachte, arbeitete Mullis in Emeryville, Kalifornien für Cetus Corporation, eine der ersten Biotechnologiefirmen. Dort wurde er mit der Herstellung der kurzen Ketten von DNA für andere Wissenschaftler aufgeladen. Mullis hat geschrieben, dass er von PCR beim Kreuzen entlang der Pazifikküste-Datenbahn 1 eine Nacht in seinem Auto [2] begriff. Er spielte in seinem Verstand mit einer neuen Methode des Analysierens der Änderungen (Veränderungen) in DNA, als er feststellte, dass er anstatt eine Methode der Verstärkung jeder möglicher DNA-Region erfunden hatte. Mullis hat gesagt, dass, bevor seine Reise vorbei war, er bereits die Aussichten eines Nobelpreises savoring. Er teilte den Nobelpreis in der Chemie mit Michael Smith 1993.
Wie Mullis auf den wissenschaftlichen Amerikaner geschrieben hat: „, anfangend mit einem einzelnen Molekül der genetisches Material DNA, kann der PCR 100 Milliarde ähnliche Moleküle an einem Nachmittag festlegen. Die Reaktion ist einfach durchzuführen. Sie benötigt no more als ein Reagenzglas, einige einfache Reagenzien und eine Quelle der Hitze.“
PCR wird verwendet, um spezifische Regionen eines DNA-Stranges zu verstärken. Diese kann ein einzelnes Gen, gerade ein Teil eines Gens oder eine Nichtkodierung Reihenfolge sein. Die meisten PCR-Methoden verstärken gewöhnlich DNA-Fragmente der niedrigen Paare von bis 10 Kilo (Kb). Einige PCR-Methoden können DNA-Fragmente von Kb bis 40 an Größe kopieren [3], der noch viel kleiner als der Gesamtkern-DNA-Gehalt einer eukaryotic Zelle ist - für Vergleich, besteht das haploideGenom einer menschlichen Zelle aus ungefähr drei Milliarde DNA-niedrigen Paaren (3 GBs).
PCR, wie aktuell geübt, benötigt einige grundlegende Bestandteile [4]. Diese Bestandteile sind:
DNA-Schablone, die die Region des verstärkt zu werden DNA-enthält Fragments
Eine oder mehrere Zündkapseln, die zu den DNA-Regionen an 5 ' und 3 ' Enden der DNA-Region sich ergänzen, die verstärkt werden soll (sehen folgendes Kapitel auf Zündkapseln)
Taq Polymerase (oder eine andere DNA-Polymerase mit einem Temperaturoptimum um ungefähr 70°C), eine DNA-Polymerase, benutzt, um ein DNA-Exemplar der verstärkt zu werden Region zu synthetisieren
Pufferlösung, die eine verwendbare chemische Umgebung für optimale Aktivität und Stabilität der DNA-Polymerase zur Verfügung stellt
ZweiwertigeKation-,Magnesium- oder Manganionen; im Allgemeinen wird Mg2+ verwendet, aber Mn2+ kann für PCR-vermittelte DNA-Mutagenese verwendet werden, da höhere Mn2+ Konzentration erhöht die Fehlerhäufigkeit während der DNA-Synthese [5]
Der PCR wird in den kleinen Reaktionsgefäßen (0.2-0.5 ml-Datenträger) durchgeführt und gewöhnlich enthält einen Reaktionsdatenträger 15-100 Î ¼ L, die in ein thermisches cycler eingesetzt werden. Dieses ist eine Maschine, die die Reaktionsgefäße innerhalb es zur exakten Temperatur erhitzt und abkühlt, die für jeden Jobstepp der Reaktion benötigt wird. Die meisten thermischen cyclers haben Kappen erhitzt, um Kondensation auf dem Innere der Reaktionsgefäßschutzkappen zu verhindern. Wechselweise kann eine Schicht Öl auf das Reaktionsgemisch platziert werden, um Verdampfung zu verhindern. Diese Maschinen kosteten mehr als $2.500 USD, ab 2004.
Zündkapseln
Um ein DNA-Fragment selektiv PCR-zu verstärken, müssen verwendbare Zündkapseln konzipiert werden und synthetisiert werden. Zündkapseln sind kurze Oligonucleotides d.h. die chemisch synthetisierten, single-stranded DNA-Fragmente - häufig nicht mehr als 50 und normalerweise nur 18 bis 25 niedrige Paare lang - Nukleotide enthalten, die zu den Nukleotiden an beiden Enden des verstärkt zu werden DNA-sich ergänzen Fragments. Diese ergänzenden Unterseiten in der Zündkapsel und IN DER DNA-Schablone erleichtern Ausglühen der Zündkapsel zur DNA-Schablone, zu der die DNA-Polymerase mit der Synthese eines neuen DNA-Stranges binden und anfangen kann, der zur DNA-Schablone sich ergänzt (wie unten beschrieben).
Die Länge der Zündkapseln und ihre gewünschte schmelzende Temperatur (TM) hängen von einigen Erwägungen ab. Das TM einer Zündkapsel -- nicht mit dem TM der Schablone DNA verwechselt werden -- wird als die Temperatur definiert, bei der Hälfte der verbindlichen Sites der Zündkapsel an der DNA-Schablone besetzt werden. Während das TM mit der Länge der Zündkapsel (bereitgestellt dem Inhalt des Guanins bleibt (g) und des Cytosins (c) im Verhältnis zu Adenin (a) und niedrigen Rückständen des Thymine (T) konstant), sich erhöht, Zündkapseln, die (niedrige Paare <15) benötigen eine niedrigere Ausglühentemperatur kurz sind (<50°C) für leistungsfähige Verstärkung. Infolge von dem in sich selbst weniger komplizierten niedrigen Aufbau der kurzen Zündkapseln, können diese in einigen Positionen auf einer DNA-Schablone möglicherweise tempern, die nicht wünschenswerte unspezifische Verstärkung ergeben würde. Einerseits unter Verwendung einer Zündkapsel, die (niedrige Paare >40) sehr lang ist, benötigt Ausglühentemperaturen, die über 80°C d.h. bei den Temperaturen sind, die mit der Aktivität und der Stabilität der DNA-Polymerase zusammenstoßen. Die optimale Länge einer Zündkapsel (mit einem G+C Inhalt von 40-60%) ist im Allgemeinen von 15 bis 40 Nukleotide mit einer Ausglühentemperatur zwischen 50°C und 74°C.
Einige PCR-Anwendungen benötigen den Gebrauch der degenerierten Zündkapseln, die Mischungen der Zündkapseln sind, die eine oder mehrere Unterschiede in den Unterseiten in spezifischen Positionen haben. Der Gebrauch der degenerierten Zündkapseln wird in Fälle gefordert, in denen die genaue Reihenfolge einer DNA-Schablone unbekannt ist, oder Verstärkung der DNA-Fragmente mit etwas unterschiedlicher Reihenfolge wird gewünscht. Z.B. können sie benötigt werden, wenn ein übereinstimmendes Gen (d.h., ein Gen mit ähnlicher Funktion, aber ungleichartiger DNA-Reihenfolge) von den verschiedenen Organismen verstärkt werden soll. Ein anderer geläufiger Gebrauch für degenerierte Zündkapseln wird benötigt, wenn Zündkapselentwurf an der Proteinreihenfolge nur durchgeführt werden kann. Während einige verschiedene Nukleotid Codons für eine Aminosäure codieren können (sehen Sie Entartung des genetischen Codes amgenetischen Code), können die meisten Proteinreihenfolgen durch einige verschiedene DNA-Reihenfolgen gekodiert werden. Eine Zündkapselreihenfolge, die dem Codon für das Aminosäureisoleucin entspricht, kann „ATH“ sein, wo A für Adenin, T für Thymine und H für Adenin, Thymine oder Cytosin steht. Gebrauch der degenerierten Zündkapseln kann die Besonderheit der PCR-Verstärkung groß verringern. Dieses Problem kann teils überwunden werden, indem man Landung PCR verwendet.
Die oben erwähnten Erwägungen stellen Zündkapsel her, einen Mehrstufenprozeß zu konzipieren, um guten Ertrag und Qualität des PCR-Produktes sicherzustellen:
Der Gaschromatographie-Inhalt sollte zwischen 40-60% sein; ideal sollte es eine gleichmäßige Verteilung von G+C und von A+T entlang der Zündkapsel geben.
Das berechnete TM für beide Zündkapseln, die in der Reaktion benutzt werden, sollte nicht sich unterscheiden >5°C.
Die ideale Ausglühentemperatur ist normalerweise 5°C unter der berechneten Zündkapsel TM. Jedoch sollte sie für einzelne Bedingungen empirisch gewählt werden.
Innere Selbst-ergänzende Haarnadeln von >4 und der Dimer >8 sollten zusammen mit langen Durchläufen vermieden werden (>4) der G-oder c-Rückstände.
Ende von den 3 der Zündkapsel 3 ' Terminusentwurf ist kritisch zum PCR-Erfolg, da der werdende DNA-Strang ' der Zündkapsel sich ausdehnt. Ende der Zündkapsel 3 ' sollte mehr als 3-4 Unterseiten, die zu jeder möglicher Region innerhalb sich oder die sich ergänzen andere Zündkapsel nicht enthalten, die in der Reaktion benutzt wird und muss die Unterseiten in der Schablone richtig abgleichen.
Es ist häufig vorzuziehend, ein G-oder c-Nukleotid ' von der Zündkapsel Terminus an den abschließenden 3 zu haben („GASCHROMATOGRAPHIE-Klemmplatte“), wie dieses leistungsfähige Strangverlängerung im PCR erhöht; mehr als drei G-oder c-Rückstände innerhalb der fünf Terminalunterseiten ', sollte Ende an den 3 jedoch, habend vermieden werden.
Während es sehr nützlich ist, diesen Korrekturlinien zu folgen in der Praxis ist es häufig unmöglich, Zündkapseln zu konzipieren, die alle oben genannten Kriterien erfüllen. Wegen der hohen Anzahl der Variablen, die PCR beeinflussen können, sogar können suboptimal konzipierte Zündkapseln gut arbeiten, also ist es im Allgemeinen ratsam, optimale Bedingungen empirisch festzustellen z.B. indem man verschiedene Zündkapselkombinationen verwendet oder ausgewählte PCR-Zustände ändert. Es gibt Computerprogramme, die im Konzipieren der Zündkapseln unterstützen können (sehen Sie externe Links), aber der abschließende Aufruf kann nach experimentellen Versuchen häufig nur gebildet werden.
Allgemeine PCR-Prozedur
Der PCR besteht normalerweise einer Reihe von aus 20 bis 35 Schleifen. Am geläufigsten, wird PCR in drei Jobstepps durchgeführt (Feige. 2), häufig vorausgegangen von einem Temperatureinfluß beim Anfang und von einem Einfluss am Ende gefolgt.
Vor der ersten Schleife während eines Initialisierungsjobsteps, wird die PCR-Reaktion häufig zu einer Temperatur von 94-96°C erhitzt (oder von 98°C, wenn extrem hitzebeständige Polymerasen benutzt werden), und diese Temperatur wird dann für 1-9 Minuten angehalten. Dieser erste Einfluss wird eingesetzt, um zu garantieren, dass die meisten der DNA-Schablone und Zündkapseln d.h. denaturiert werden die die DNA geschmolzen wird, indem man die Wasserstoffbindungen zwischen ergänzenden Unterseiten in zwei DNA-Strängen stört. Auch einige PCR-Polymerasen benötigen diesen Jobstepp für Aktivierung (sehen Sie heiß-beginnen PCR). Nach diesem Einfluss fängt das Radfahren, mit einem Jobstepp an 94-98°C für 20-30 Sekunden an (Denaturierungjobstep).
Die Denaturierung wird vom Ausglühenjobstep gefolgt. In diesem Jobstepp wird die Reaktionstemperatur gesenkt, damit die Zündkapseln zur single-stranded DNA-Schablone anbringen können. Die Temperatur an diesem Jobstepp hängt vom TM der Zündkapseln (sehen Sie oben) ab und ist normalerweise zwischen 50-64°C für 20-40 Sekunden.
Der Ausglühenjobstep wird von einem Extensions-/Verlängerungjobstep gefolgt, während dessen die DNA-Polymerase die DNA-Schablone kopiert und beginnt an den Zündkapseln, die zu beiden seiner Stränge getempert werden. Die Temperatur an diesem Jobstepp hängt von der benutzten DNA-Polymerase ab. Taq Polymerase hat ein Temperaturoptimum von 70-74°C; so in den meisten Fällen während der Extension wird eine Temperatur von 72°C verwendet. Die Extensionszeit hängt von der benutzten DNA-Polymerase und von der Länge des verstärkt zu werden DNA- abfragments. Da ein praktischer ungefährer Richtwert, bei seiner optimalen Temperatur, die DNA-Polymerase tausend Unterseiten in einer Minute polymerisiert. Ein abschließender Verlängerungjobstep wird häufig nach der letzten Schleife verwendet, um zu garantieren, dass jede restliche single-stranded DNA vollständig kopiert wird. Dieses unterscheidet sich von den anderen Verlängerungjobsteps nur dadurch, dass es länger ist--gewöhnlich 10-15 Minuten. Ein abschließender Einfluss von 4-15°C während einer unbestimmten Zeit wird häufig eingesetzt, um kurzfristige Lagerung der Reaktion zu erlauben, besonders wenn Reaktionen über Nacht laufen gelassen werden, und kann nicht sofort nach dem Radfahren gelöscht werden.
Abbildung 2: Schematische Zeichnung der PCR-Schleife. (1) denaturierend 94-96°C. (2) am Ausglühen (z.B.) 68°C. (3) an der Verlängerung an 72°C (P=Polymerase). (4) ist die erste Schleife komplett. Die zwei resultierenden DNA-Stränge bilden die Schablone DNA für die folgende Schleife und so verdoppeln die Menge von DNA an jeder neuen Schleife (insgesamt drei Schleifen wird oben gezeigt).
Beispiel PCR-Protokoll
Die Zeiten und die Temperaturen, die in diesem Beispiel gegeben werden, werden von einem PCR-Programm genommen, das erfolgreich auf einem 250 BP-Fragment des C-Terminus von Insulin-wie Wachstumfaktor (IGF) Schablone verwendet wurde: Tatsache.
Gelelektrophoresebild eines Standard-PCR. Zwei Sets der spezifischen Zündkapseln wurden benutzt, um ein Gen von drei verschiedenen Geweben zu verstärken. Während das Gel darstellt, ermangelt Gewebe #1 dieses Gen, während Gewebe #2 und #3 dieses Gen besitzen.
Das Reaktionsgemisch besteht
1.0 µl DNA-Schablone (100 ng/µl)
2.5 µl der Zündkapsel, µl 1.25 pro Zündkapsel (100 ng/µl)
1.0 µl Pfu-Polymerase
1.0 µl Nukleotide
5.0 µl Pufferlösung
89.5 µl Wasser
Ein 200 µl Reaktionsgefäß, welches die 100 µl Mischung enthält, wird in das thermocycler eingesetzt.
Der pcr-Prozess besteht aus den folgenden Jobstepps:
Initialisierung. Die Mischung ist an 96°C erhitzt, damit 5 Minuten garantieren, dass die DNA-Stränge sowie die Zündkapseln geschmolzen sind. Die DNA-Polymerase kann an der Initialisierung anwesend sein, oder es kann nach diesem Jobstepp hinzugefügt werden.
Schmelzen, wo es an 96°C für 30 Sekunden erhitzt ist. Für jede Schleife ist dieses normalerweise genügend Zeit, damit die DNA denaturiert.
Ausglühen durch die Heizung an 68°C für 30 Sekunden: Die Zündkapseln bewegen sich, verursacht durch Brownische Bewegung. Wasserstoffbindungen entlang kurzen Ausdehnungen von DNA sind ständig zwischen der single-stranded Zündkapsel und der single-stranded Schablone gebildet und gebrochen. Beständige Bindungen werden nur gebildet, wenn die Zündkapselreihenfolge genau die Schablonenreihenfolge passt, und auf diesem kurzen Stück double-stranded DNA (Schablone und Zündkapsel), kann die Polymerase und die Schablone, zu kopieren beginnen anbringen. Sobald diese Extension ein längeres double-stranded DNA-Segment erstellt hat, ist das TM dieser double-stranded Region jetzt größer als die Ausglühen- oder Extensionstemperatur.
Verlängerung durch erhitzen72â°c für 45 Sekunden: Dieses ist die ideale Arbeitstemperatur für die Polymerase. Die kombinierten Wasserstoffbindungen zwischen der ausgedehnten Zündkapsel und der DNA-Schablone sind jetzt genug stark, den Kräften zu widerstehen, die diese Anziehungskräfte bei der höheren Temperatur brechen. Zündkapseln, die auf Positionen ohne genaues sind - gleichen ab, schmelzen weg von der Schablone (wegen der höheren Temperatur) und sind nicht ausgedehnt.
Die DNA-Polymerase kondensiert die 5 ' - phosphatieren Sie Gruppe derdNTPs mit in zur Richtung 3 ' - Hydroxylgruppe am Ende des werdenden (ausdehnenden) DNA-Stranges, d.h. die Polymerase hinzufügt der dNTPs, die zur Schablone in 5 ' 3 ' Richtung sich ergänzen und so lesen die Schablone 3 ' bis 5 '.
Jobstepps 2-4 werden 25-35mal wiederholt, aber mit guten Zündkapseln und frischer Polymerase, können 15 bis 20 Schleifen genügend sein.
Mischung wird an 7°C. angehalten. Dieses ist nützlich, wenn man den PCR am Abend kurz vor dem Verlassen des Labors beginnt, also kann es über Nacht laufen. Die DNA wird nicht an 7°C nach gerade einer Nacht beschädigt.
Das korrekte PCR-Produkt kann durch seine Größe, unter Verwendung der Agarosegelelektrophorese identifizierent werden. Agarosegelelektrophorese ist eine Prozedur, die aus Laden DNA in kleine Vertiefungen eines Agarosegels und einen elektrischen Strom am Gel dann -anwenden besteht. Infolgedessen bewegen sich die kleineren DNA-Stränge schneller als die größeren Stränge durch das Gel in Richtung zum positiven Strom. Die Größe des PCR-Produktes kann festgestellt werden, indem man es mit einer DNA-Strichleiter, die die DNA-Fragmente der bekannten Größe enthält, auch geladen auf das Gel vergleicht (Feige. 3).
Da PCR d.h. sehr empfindlich ist nur einige DNA-Moleküle für Verstärkung über einigen Größenordnungen benötigt, sollten ausreichende Maßnahmen, Verschmutzung von jeder möglicher DNA zu vermeiden, die in der Laborumgebung vorhanden ist (Bakterium, Viren, Haut etc. des Laborstabes) ergriffen werden. So DNA-Beispielvorbereitung, Reaktionsgemischassemblierung und der PCR-Prozess, zusätzlich zur folgenden ReaktionsProduktanalyse, wenn alle in den unterschiedlichen Bereichen durchgeführt werden. In der Praxis sollte ein Bereich Reaktion vor dem PCR und einem anderen Bereich zu verarbeitendem Pfosten-PCR eingesetzt werden, wie Elektrophorese oder Reinigung der PCR-Produkte. Für die Vorbereitung der Reaktionsgemische, wird ein Kabinett der laminaren Strömung mit UVlampe empfohlen, und Pipetten mit Filterumkippen sollten benutzt werden. Frische Handschuhe sollten für jeden PCR-Jobstepp sowie Distanzadressepipetten mit Aerosolfiltern benutzt werden. Die Reagenzien für PCR sollten separat vorbereitet werden und nur zu diesem Zweck benutzt werden. Aliquoten sollten separat gespeichert werden von anderen DNA-Proben. Eine Steuerreaktion, Schablone DNA auslassend (auch genannt worden negative Steuerung), sollte neben experimentellem PCRs immer durchgeführt werden, um auf möglicher Verschmutzung der Reagenzien mit äußerer DNA zu überprüfen oder auf Zündkapsel multimer Anordnung.
Haarnadeln
Sekundärstrukturen in der DNA, verursacht, indem sie zwischen Nukleotiden auf dem gleichen Strang des Moleküls Unterseite-zusammenpassen, können das Falten oder sogar das Knoten der DNA-Schablone oder der Zündkapseln verursachen und zu verringerten Ertrag oder Gesamtstörung der Reaktion führen. Haarnadeln, direkte Falte der DNA, die durch einen Durchlauf der ergänzenden Unterseiten verursacht wird oder eine Umstellung, sind die geläufigsten Probleme dieser Sortierung.
Gewöhnlich fordert dieses das Wählen der verschiedenen Zündkapseln; Sekundärstrukturen in der Schablone DNA sind nicht so ernst wie die in den Zündkapseln, da die DNA-Polymerase „heraus“ die meiste Sekundärstrukturen Schablone flachdrückt: Tatsache, es sei denn sie besonders robust sind.
Jedoch wenn Gebrauch von Haarnadel-Formung der Zündkapseln, wie sein kann der Fall in verbindenem und klonendem PCR, das Problem kann mittels DMSO oder GlyzerinSchablone ein wenig verbessert werden notwendig ist: Tatsache; diese Chemikalien können dem PCR mastermix hinzugefügt werden, um Sekundärstrukturen zu unterbrechen.
Polymerasefehler
Taq Polymerase ermangelt eine exonuclease 3 ' bis 5 ' Aktivität. Dieses bildet es unmöglich, damit es den Korrektur lesendes Fehler d.h. die letzte Unterseite zu überprüfen, die er eingesetzt hat und sie zu besteuern tut, wenn die Unterseite nicht mit der Unterseite im ergänzenden Strang abgleicht. Dieser Mangel in 3 ' bis 5 ' Korrektur lesendes ergibt eine hohe Fehlerhäufigkeit von ungefähr 1 in 10.000 Unterseiten, die, wenn ein Fehler früh im PCR auftritt, Aufspeicherung eines großen Anteils verstärkter DNA mit falscher Reihenfolge im Endprodukt verursachen können. Exonuclease einige „die high-fidelity“ DNA-Polymerasen, nachdem sieausgeführt 3 ' bis 5 ' Aktivität sieausgeführt hatten, sind vorhanden geworden, die genauere Verstärkung für Gebrauch in der Verstärkung für das Sequenziell ordnen oder das Klonen ermöglichen. Beispiele der Polymerasen mit exonuclease 3 ' bis 5 ' Aktivität umfassen: KOD DNA-Polymerase, ein recombinant Formular von Thermococcus kodakaraensis KOD1; Entlüftungsöffnung, die von den Thermococcus litoralis extrahiert wird; Pfu DNA-Polymerase, die vom Pyrococcus furiosus extrahiert wird; und Pwo, das vom Pyrococcus woesii extrahiert wird. Schablone: Tatsache
Größe und andere Beschränkungen
PCR arbeitet betriebsbereit mit DNA der hohen zwei bis drei tausend niedrigen Paare in der Länge. Jedoch über dieser Größe, verringern sich Produkterträge häufig, wie bei Zunahme der stochastischen Effekte der Länge wie vorzeitiger Endpunkt durch die Polymerase anfangen Sie, die Leistungsfähigkeit des PCR zu beeinflussen. Es ist möglich, größere Stücke von bis 50.000 niedrigen Paaren mit einer langsameren Heizungsschleife und speziellen Polymerasen zu verstärken. Diese sind die Polymerasen, die zu einem processivity-erhöhenc$dna-bindenen Protein fixiert werden und bilden sie, buchstäblich „festhalten“ an der längeren DNA [6][7].
Andere wertvolle Eigenschaften der chimeric Polymerasen TopoTaq und PfuC2 des Prototyps umfassen erhöhte Hitzebeständigkeit, Besonderheit und Widerstand zu den Verschmutzern und zu den Hemmnissen [8][9]. Sie wurden unter Verwendung eindeutige Schnecke-Haarnadel-Schnecke (HhH) der DNA-verbindlichen Gebiete von Topoisomerase V [10] vom hyperthermophile Methanopyrus kandleri ausgeführt. Chimeric Polymerasen überwinden viele Beschränkungen der gebürtigen Enzyme und werden in der direkten PCR-Verstärkung von den Zellkulturen und sogar von den Nahrungsmittelproben verwendet und so zusammen umgehen mühsame DNA-Lokalisierungsjobsteps. Eine robuste Strangdistanzadresseaktivität der Mischling TopoTaq Polymerase hilft, PCR-Probleme mit #Hairpins und G-einprogrammiert doppelten Schnecken zu lösen, weil Schnecken mit einem hohen GASCHROMATOGRAPHIE-Zusammenhang eine höhere schmelzende Temperatur [11] besitzen.
Unspezifischer Schiess-Zündsatz
Unspezifische Schwergängigkeit der Zündkapseln häufig tritt auf und kann an den Wiederholungsreihenfolgen in der DNA-Schablone, in der unspezifischen Schwergängigkeit zwischen Zündkapsel und Schablone und unvollständigen in der Zündkapselschwergängigkeit liegen und verlässt ' Ende die 5 der Zündkapsel unabhängig zur Schablone. Unspezifische Schwergängigkeit wird auch häufig erhöht, wenn degenerierte Zündkapseln im PCR benutzt werden. Handhabung Konzentrationen der Ausglühentemperatur- und -magnesiumdes ion (die DNA-und RNS-Interaktionen stabilisieren), kann Besonderheit erhöhen. Unspezifischer Schiess-Zündsatz während der Reaktionsvorbereitung bei den niedrigeren Temperaturen kann, indem man verhindert werden „verwendet, heiß-beginnen“ Polymeraseenzyme, deren aktive Site durch einen Antikörper geblockt wird, oder Chemikalie, die nur einmal verdrängt, die Reaktion zu 95ËšC während des Denaturierungjobsteps der ersten Schleife erhitzt wird.
Eine neue Methode, die thermophilen Enzyme zu warten, die bei der niedrigen Temperatur absolut unaktiviert sind, wurde während der strukturellen Studien der hyperthermophilen DNA-bindenen Enzyme [12] identifizierent. Eine besonders ausgeführte TopoTaq Polymerase aktiviert sofort an der Hochtemperatur und überwindt Beschränkungen von herkömmlichem „heiß-beginnen“ Enzyme, die Antikörperdenaturierung an >90ËšC für Aktivierung benötigen. Zusätzlich wird seine Aktivität nach Beendigung von PCR bei der niedrigen Temperatur geblockt.
Verschachtelter PCR - Verschachtelter PCR soll die Besonderheit erhöhen, wenn man eine Ziel DNA-Reihenfolge und so verstärkt um den Hintergrund wegen der unspezifischen Verstärkung von DNA zu verringern. Zwei Sets Zündkapseln werden in zwei aufeinander folgenden PCR-Reaktionen benutzt. In der ersten Reaktion wird ein Paar Zündkapseln benutzt, um DNA-Produkte festzulegen, die außer dem beabsichtigten Ziel, aus unspezifisch verstärkten DNA-Fragmenten noch bestehen können. Die Produkte (manchmal nachdem Gelreinigung nachdem Elektrophorese des PCR-Produktes) sind dann verwendete sofort PCR-Reaktion mit einem Set Zündkapseln, deren verbindliche Sites zu den Zündkapselpaaren vollständig oder teilweise unterschiedlich sind, die in der ersten Reaktion verwendet werden, aber sind auch innerhalb des beabsichtigten DNA-Ziels. Diese verschachtelten Zündkapseln verstärken spezifisch die Reihenfolge innerhalb des beabsichtigten Ziels. Verschachtelter PCR ist häufig erfolgreicher, wenn es spezifisch lange DNA-Fragmente als herkömmlicher PCR verstärkt, aber es benötigt ausführlicheres Wissen der Zielreihenfolgen.
Intersequence spezifischer (ISSR) PCR
Verbindung-vermittelter PCR
Umgekehrter PCR - Umgekehrter PCR ist eine Methode, die angewendet wird, um PCR zu erlauben, wenn nur eine interne Reihenfolge bekannt. Dieses ist besonders nützlich, wenn man angrenzende Reihenfolgen zu den verschiedenen genomic Einsätzen identifizierent. Vor dem Schnitt dieses bezieht eine Reihe von Verdauung und von Selbstverbindung, durch einen Endonuclease, mit dem Ergebnis der bekannten Reihenfolgen an jedem Ende der unbekannten Reihenfolge mit ein.
RT-PCR - RT-PCR (Rückübertragung PCR) ist eine Methode, die angewendet wird, um eine bekannte Reihenfolge von einer Zelle oder von einer GewebeRNS zu verstärken, zu lokalisieren oder zu identifizierenen. Die pcr-Reaktion wird von einer Reaktion unter Verwendung des Rücktranscriptase vorausgegangen, um RNS in cDNA zu konvertieren. RT-PCR ist im ein Profil erstellenden Ausdruck, um den Ausdruck eines Gens festzustellen oder die Reihenfolge einer RNS-Abschrift, einschließlich Übertragunganfangs- und Endpunktsites zu identifizierenen und, wenn die genomic DNA-Reihenfolge eines Gens bekannt, den Standort von Exons und von Introns im Gen abzubilden am meisten benutzt. ' Wird Ende die 5 eines Gens (entsprechend der Übertragunganfangssite) gewöhnlich durch eine RT-PCR Methode identifizierent, benannt RACE-PCR, Kurzschluss für schnelle Verstärkung der cDNA Enden.
Versammlung PCR - Versammlung PCR ist die vollständig künstliche Synthese der langen Genprodukte, indem es PCR auf einem Pool der langen Oligonucleotides mit kurzen überlappenden Segmenten durchführt. Die Oligonucleotides wechseln zwischen Richtung und antisense Richtungen ab, und die überlappenden Segmente dienen, die PCR-Fragmente zu bestellen, damit sie selektiv ihr Endprodukt produzieren.
Asymetrischer PCR - Asymetrischer PCR wird verwendet, um einen Strang der ursprünglichen DNA vorzugsweise zu verstärken mehr als der andere. Er findet Gebrauch in einen Typen Sequenziell ordnen und Hybridation, die prüft, wohin, nur ein der zwei ergänzenden Standplätze zu haben ideal ist. PCR wird wie üblich, aber mit einem großen Überfluss der Zündkapseln für den ausgesuchten Strang durchgeführt. Wegen der langsamen (arithmetischen) Verstärkung später in der Reaktion, nachdem die Begrenzungszündkapsel aufgebraucht worden ist, werden Extraschleifen von PCR benötigt. Eine neue Änderung auf diesem Prozess, bekannt als Linear-Nach-D-Exponential-PCR (LATE-PCR), Gebrauch eine Begrenzungszündkapsel mit einer höheren schmelzenden Temperatur (TM) als die überschüssige Zündkapsel, Reaktions-Leistungsfähigkeit als die Begrenzungszündkapselkonzentration beizubehalten verringert Mittlerreaktion.
Quantitativer PCR - Q-PCR (quantitativer PCR) wird verwendet, um die Quantität eines PCR-Produktes (vorzugsweise Istzeit) zu messen. Es ist die Methode der Wahl, zum Mengen, DNA, cDNA oder RNS zu beginnen quantitativ zu messen. Q-PCR ist allgemein verwendet, festzustellen, ob eine DNA-Reihenfolge in einer Probe und in der Zahl seinen Exemplaren in der Probe anwesend ist. Die Methode mit aktuell dem höchsten Niveau der Genauigkeit ist quantitativer Istzeit PCR. Es häufig bekannt verwirrend als RT-PCR (Echtzeit-PCR) oder RQ-PCR. QRT-PCR oder RTQ-PCR sind passendere Kontraktionen. RT-PCR spricht geläufig Rückübertragung PCR (sehen Sie oben) an, der in Verbindung mit Q-PCR häufig benutzt ist. QRT-PCR Methoden benutzen Leuchtstofffärbungen, wie Sybr Grün, oder das fluorophore-Enthalten von DNA prüft, wie TaqMan, um die Menge des verstärkten Produktes in der Istzeit zu messen.
Landung PCR - Landung PCR ist eine Variante von PCR, der unspezifisches Zündkapselausglühen verringert, indem es stufenweise die Ausglühentemperatur senkt, wie das PCR-Radfahren weiterkommt. Die Ausglühentemperatur an den intial Schleifen ist normalerweise einige Grad über dem TM der benutzten Zündkapseln, während an den neueren Schleifen, es ist einige Grad unter der Zündkapsel TM. Die höheren Temperaturen geben größere Besonderheit für Zündkapselschwergängigkeit, und die niedrigeren Temperaturen ermöglichen leistungsfähigere Verstärkung von den spezifischen Produkten, die während der Anfangsschleifen gebildet werden.
Heiß-beginnen Sie PCR ist eine Technik, die unspezifischen Schiess-Zündsatz verringert, der während der Vorbereitung der Reaktionsbestandteile auftritt. Bevor dem Hinzufügen der Polymerase die Technik kann manuell durchgeführt werden, indem man einfach kurz die Reaktionsbestandteile bei der schmelzenden Temperatur (z.B., 95ËšC) erhitzt. Fachkundige Enzymsysteme sind entwickelt worden, die die Aktivität der Polymerase bei Raumtemperatur, entweder durch die Schwergängigkeit eines Antikörpers oder durch das Vorhandensein der kovalent gesprungenen Hemmnisse hemmen, die sich nur nach einem Hochtemperaturaktivierungsjobstep trennen. Heiß-beginnen Sie,/kalt-beenden Sie PCR wird erzielt mit neuen hybriden Polymerasen, die bei Raumtemperatur unaktiviert sind und sofort bei der Verlängerungtemperatur aktiviert sind.
Kolonie PCR - Bakterielle Klone (Escherichia Coli) können für die korrekten Verbindungprodukte gerastert werden. Ausgewählte Kolonien werden mit einem sterilen Toothpick von einer Agaroseplatte ausgewählt und gebetupft in die Vorlagenmischung oder in das sterile Wasser. Zündkapseln (und die Vorlagenmischung) werden hinzugefügt - das PCR-Protokoll muss mit einer ausgedehnten Zeit an 95ËšC begonnen werden, wenn Standardpolymerase benutzt wird, oder mit Denaturierungjobstep an 100ËšC und an der speziellen chimeric DNA-Polymerase [11] verkürzen Sie.
Multiplex-PCR - Der Gebrauch von mehrfachen, eindeutigen Zündkapselsets innerhalb einer einzelnen PCR-Reaktion, amplicons der unterschiedlichen Größen zu produzieren spezifisch zu den verschiedenen DNA-Reihenfolgen. Indem man sofort mehrfache Gene zielt, kann zusätzliche Information von einem einzelnen Probelauf gewonnen werden, der anders mehrmals die Reagenzien und mehr Zeit durchzuführen benötigen würde. Temperntemperaturen für jedes der Zündkapselsets müssen optimiert werden, um innerhalb einer einzelnen Reaktion richtig zu arbeiten, und amplicon Größen d.h. ihre niedrige Paarlänge, sollten genug unterschiedlich sein, eindeutige Bänder zu bilden, wenn sie durch Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden.
Methylierung spezifischer PCR - Methylierung spezifischer PCR (MSP) wird verwendet, um Methylierung von CpG Inseln in genomic DNA zu entdecken. DNA wird zuerst mit Natriumbisulfit behandelt, das unmethylated Cytosinunterseiten in Urazil konvertiert, das durch PCR-Zündkapseln als Thymine erkannt wird. Zwei PCR-Reaktionen werden dann auf der geänderten DNA, unter Verwendung der Zündkapselsets durchgeführt, die ausgenommen in alle mögliche CpG Inseln innerhalb der Zündkapselreihenfolgen identisch sind. An diesen Punkten erkennt ein Zündkapselset DNA mit cytosines, um methylierte DNA zu verstärken, und ein Set erkennt DNA mit Urazil oder Thymine, um unmethylated DNA zu verstärken. MSP unter Verwendung des qPCR kann auch durchgeführt werden, um quantitatives eher als qualitative Informationen über Methylierung zu erreichen.
Neuentwicklungen in den PCR-Techniken
Eine neuere Methode, die eine Temperaturschleife ausschließt, aber benutzt Enzyme, ist helicase-abhängige Verstärkung.
TAIL-PCR, et al. entwickelt von Liu 1995, ist der thermische asymetrische verschachtelte PCR.
PCR kann für eine ausgedehnte Vielzahl von Experimenten und von Analysen verwendet werden. Einige Beispiele werden unten behandelt.
Genetischer Fingerabdruck
Genetischer Fingerabdruck ist eine gerichtliche Technik, die verwendet wird, um eine Person zu identifizierenen, indem er seine oder DNA mit einer gegebenen Probe vergleicht. Ein Beispiel ist Blut von einem Tatort, der genetisch mit Blut von einem Verdächtigen verglichen wird. Die Probe kann nur eine kleine Menge DNA enthalten (erhalten von einer Quelle wie Blut, Samen, Speichel, Haar oder anderem organischem Material). Theoretisch gerade ist ein einzelner Strang erforderlich. Zuerst bricht man die DNA-Probe in Fragmente unter Verwendung restriction enzymes; then amplifies them using PCR. The amplified fragments are then separated using gel electrophoresis. The overall layout of the DNA fragments is called a DNA fingerprint. Since there is a very tiny possibility that two individuals may have the same sequences (one in several million), the technique is more effective at acquitting a suspect than proving the suspect guilty.Template:Fact
Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments. (1) Father. (2) Child. (3) Mother. The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint.
Although these resulting 'fingerprints' are unique (except for identical twins), genetic relationships, for example, parent-child or siblings, can be determined from two or more genetic fingerprints, which can be used for paternity tests (Fig. 4). A variation of this technique can also be used to determine evolutionary relationships between organisms.
Detection of hereditary diseases
The detection of hereditary diseases in a given genome is a long and difficult process, which can be shortened significantly by using PCR. Each gene in question can easily be amplified through PCR by using the appropriate primers and then sequenced to detect mutations.
Viral diseases, too, can be detected using PCR through amplification of the viral DNA. This analysis is possible right after infection, which can be from several days to several months before actual symptoms occur. Such early diagnoses give physicians a significant lead in treatment.
Cloning genes
Cloning a gene, not to be confused with cloning a whole organism, describes the process of isolating a gene from one organism and then inserting it into another organism (now termed a genetically modified organism (GMO)). PCR is often used to amplify the gene, which can then be inserted into a vector (a vector is a piece of DNA which 'carries' the gene into the GMO) such as a plasmid (a circular DNA molecule) (Fig. 5). The DNA can then be transferred into an organism (the GMO) where the gene and its product can be studied more closely. Expressing a cloned gene (when a gene is expressed the gene product (usually protein or RNA) is produced by the GMO) can also be a way of mass-producing useful proteins, for example medicines or the enzymes in biological washing powders. The incorporation of an affinity tag on a recombinant protein will generate a fusion protein which can be more easily purified by affinity chromatography.
Figure 5: Cloning a gene using a plasmid. (1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.
Mutagenesis
Mutagenesis is a way of making changes to the sequence of nucleotides in the DNA. There are situations in which one is interested in mutated (changed) copies of a given DNA strand, for example, when trying to assess the function of a gene or in in-vitro protein evolution (also known as Directed evolution). Mutations can be introduced into copied DNA sequences in two fundamentally different ways in the PCR process. Site-directed mutagenesis allows the experimenter to introduce a mutation at a specific location on the DNA strand. Usually, the desired mutation is incorporated in the primers used for the PCR program. Random mutagenesis, on the other hand, is based on the use of error-prone polymerases in the PCR process. In the case of random mutagenesis, the location and nature of the mutations cannot be controlled. One application of random mutagenesis is to analyze structure-function relationships of a protein. By randomly altering a DNA sequence, one can compare the resulting protein with the original and determine the function of each part of the protein.
Analysis of ancient DNA
Using PCR, it becomes possible to analyze DNA that is thousands of years old. PCR techniques have been successfully used on animals, such as a forty-thousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptian mummies to the identification of a RussianTsar.
Genotyping of specific mutations
Through the use of allele-specific PCR, one can easily determine which allele of a mutation or polymorphism an individual has. Here, one of the two primers is common, and would anneal a short distance away from the mutation, while the other anneals right on the variation. The 3' end of the allele-specific primer is modified, to only anneal if it matches one of the alleles. If the mutation of interest is a T or C single nucleotide polymorphism (T/C SNP), one would use two reactions, one containing a primer ending in T, and the other ending in C. The common primer would be the same. Following PCR, these two sets of reactions would be run out on an agarose gel, and the band pattern will tell you if the individual is homozygous T, homozygous C, or heterozygous T/C. This methodology has several applications, such as amplifying certain haplotypes (when certain alleles at 2 or more SNPs occur together on the same chromosome Linkage Disequilibrium) or detection of recombinant chromosomes and the study of meiotic recombination.
Comparison of gene expression
Researchers have used traditional PCR as a way to estimate changes in the amount of a gene's expression. Ribonucleic acid (RNA) is the molecule into which DNA is transcribed prior to making a protein, and those strands of RNA that hold the instructions for protein sequence are known as messenger RNA (mRNA). Once RNA is isolated it can be reverse transcribed back into DNA (complementary DNA to be precise, known as cDNA), at which point traditional PCR can be applied to amplify the gene, this methodology is called RT-PCR. In most cases if there is more starting material (mRNA) of a gene then during PCR more copies of the gene will be generated. When the products of the PCR process are run on an agarose gel (see Figure 3 above) a band, corresponding to a gene, will appear larger on the gel (note that the band remains in the same location relative to the ladder, it will just appear fatter or brighter). By running samples of amplified cDNA from differently treated organisms one can get a general idea of which sample expressed more of the gene of interest. A quantative RT-PCR method has been developed, it is called Real-time PCR .
History
Polymerase chain reaction was invented by Kary Mullis[2][13]. He was awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993 for his invention, only seven years after he and his colleagues at Cetus first reduced his proposal to practice. The idea was to develop a process by which DNA could be artificially multiplied through repeated cycles of duplication driven by an enzyme called DNA polymerase.
DNA polymerase occurs naturally in living organisms. In cells it functions to duplicate DNA when cells divide in mitosis and meiosis. Polymerase works by binding to a single DNA strand and creating the complementary strand. In the first of many original processes, the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 94°C (201°F). At this temperature, however, the DNA polymerase used at the time were destroyed, so the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. The original procedure was very inefficient, since it required a great deal of time, large amounts of DNA polymerase, and continual attention throughout the process.
Later, this original PCR process was greatly improved by the use of DNA polymerase taken from thermophilic bacteria grown in geysers at a temperature of over 110°C (230°F). The DNA polymerase taken from these organisms is stable at high temperatures and, when used in PCR, does not break down when the mixture was heated to separate the DNA strands. Since there was no longer a need to add new DNA polymerase for each cycle, the process of copying a given DNA strand could be simplified and automated.
One of the first thermostable DNA polymerases was obtained from Thermus aquaticus and was called "Taq." Taq polymerase is widely used in current PCR practice. A disadvantage of Taq is that it sometimes makes mistakes when copying DNA, leading to mutations (errors) in the DNA sequence, since it lacks 3'→5' proofreading exonuclease activity. Polymerases such as Pwo or Pfu, obtained from Archaea, have proofreading mechanisms (mechanisms that check for errors) and can significantly reduce the number of mutations that occur in the copied DNA sequence. However these enzymes polymerise DNA at a much slower rate than Taq. Combinations of both Taq and Pfu are available nowadays that provide both high processivity (fast polymerisation) and high fidelity (accurate duplication of DNA).
PCR has been performed on DNA larger than 10 kilobases, but the average PCR is only several hundred to a few thousand bases of DNA.
The problem with long PCR is that there is a balance between accuracy and processivity of the enzyme. Usually, the longer the fragment, the greater the probability of errors.
Patent wars
The PCR technique was patented by Cetus Corporation, where Mullis worked when he invented the technique in 1983. The Taq polymerase enzyme is also covered by patents. There have been several high-profile lawsuits related to the technique, including an unsuccessful lawsuit brought by DuPont. The pharmaceutical company Hoffmann-La Roche purchased the rights to the patents in 1992 and currently holds those that are still protected.
A related patent battle over the Taq polymerase enzyme is still ongoing in several jurisdictions around the world between Roche and Promega. Interestingly, it seems possible that the legal arguments will extend beyond the life of the original PCR and Taq polymerase patents, which expired on March 28, 2005.[14]
