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Jason wenig - Dojindo molekulare Technologie-technische Unterstützung
Hintergrund der Zellzählung Kit-8
Zellzählung Kit-8 (CCK-8) erlaubt bequeme Proben unter Verwendung Dojindos tetrazolium des Salzes, WST-8 (2 (2-methoxy-4-nitrophenyl) - 3 (4-nitrophenyl) - 5 (2,4-disulfophenyl) - 2H-tetrazolium, Mononatrium- Salz), das eine wasserlösliche formazan Färbung nach bioreduction in Anwesenheit einer Elektronfördermaschine produziert, 1-Methoxy PMS. Lösung CCK-8 wird direkt den Zellen hinzugefügt; kein Vormischen der Bestandteile wird benötigt. CCK-8 ist eine empfindliche inaktive kolorimetrische Probe für die Bestimmung der Zahl entwicklungsfähigen Zellen in den Zellenverbreitungs- und -cytotoxizitätproben. WST-8 bioreduced durch zellulare Dehydrogenasen zu einem orange formazan Produkt, das im Gewebekulturmedium löslich ist. Die Menge von formazan produziert ist direkt zur Zahl lebenden Zellen proportional. Die Abfragungsempfindlichkeit der Zellenverbreitungsproben unter Verwendung WST-8 ist höher als Proben unter Verwendung der anderen tetrazolium Salze wie MTT, XTT, MTS oder WST-1.
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Materialien brauchten für Zellzählung Kit-8
Microplate Leser: 450-490 Nanometer-Filter
96 Vertiefung microplate
Multipippet (Kanal 8 oder 12 für UL 10 - 100)
Brutkasten C02
Zellenkostenzähler oder Hematocytometer
Prozedur der Zellzählung Kit-8
Jobstepps
Probierverfahren 1. bereiten eine Zellenaufhebung mit 50.000-100.000 cells/ml unter Verwendung eines passenden Kulturmediums vor.
2. Fügen Sie 100 µl der Zellenaufhebung jeder gut einer Platte mit 96 Vertiefungen hinzu.
3. Brüten Sie die Platte bei 37 ºC.a) aus
4. Fügen Sie 10 µl von verschiedenen Konzentrationen einer Lösung hinzu, um testedb) zu jedem zu sein gut.
5. Brüten Sie die Platte bei 37 ºC während eines bestimmten Zeitraums, wie 24, 48 oder 72 Stunden aus.
6. Fügen Sie 10 µl CCK-8 solutionc) jedem gut, hinzu und brüten Sie die Platte bei 37 ºC für 1-4 hours.d) aus
7. Lesen Sie das O.D. bei 450 Nanometer, um die Zellenentwicklungsfähigkeit in jedem gut festzustellen.
a) Nachtvorinkubation in einem CO2-Brutkasten wird empfohlen. B) Verwenden Sie den Kulturmedium oder das PBS, um die Lösungen vorzubereiten. c) Wenn die geprüft zu werden Lösung Reduktionstätigkeiten hat, brüten Sie die Lösung und das CCK-8 ohne Zellen aus, um die Hintergrundabsorption bei 450 Nanometer festzustellen. Wenn die Absorption geringfügig klein ist, fügen Sie Lösung CCK-8 jedem gut hinzu. Wenn die Absorption hoch ist, löschen Sie den Kulturmedium und waschen Sie Zellen zweimal mit dem Medium, dann fügen Sie 100 µl der Lösung des Kulturmediums und 10 µl CCK-8 hinzu. d) Längere Ausbrütung kann für Leukozytezellen notwendig sein.
Anmerkungen der Zellzählung-Kit-8
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Protokoll der Zellzählung-Kit-8
1. Wieviele Zellen sollten in einer Vertiefung dort sein? Für anhaftende Zellen mindestens 1.000 Zellen sind notwendig pro Vertiefung (100 µl Medium) wenn man eine Standardplatte mit 96 Vertiefungen verwendet. Für Leukozyten mindestens sind 2.500 Zellen pro Vertiefung (Medium 100µl) wegen der niedrigen Empfindlichkeit notwendig. Die empfohlene Höchstzahl der Zellen pro gut für die Platte mit 96 Vertiefungen ist 25.000. Wenn 24 wohle oder 6 wohle Platten für diese Probe benutzt werden, berechnen Sie bitte die Zahl Zellen pro Vertiefung dementsprechend, und justieren Sie den Datenträger der Lösung CCK-8 in jedem gut bis 10% des Gesamtdatenträgers.
2. Kann dieser Installationssatz mit einer Platte mit 364 Vertiefungen benutzt werden? Ja können Sie diesen Installationssatz für eine Platte mit 384 Vertiefungen benutzen. Fügen Sie Lösung CCK-8 mit 1/10 Datenträger des Kulturmediums in einer Vertiefung hinzu. Wenn der Datenträger von hinzugefügt zu werden zu kleines, verdünntes CCK-8 zur Hälfte mit dem Medium und 1/5 des Datenträgers des Kulturmediums in einer Vertiefung hinzuzufügen CCK-8 ist.
3. Befleckt CCK-8 entwicklungsfähige Zellen? Nicht befleckt es nicht entwicklungsfähige Zellen, weil ein wasserlösliches tetrazolium Salz (WST-8) für die Lösung CCK-8 benutzt wird. Der Elektronvermittler, 1-Methoxy PMS, empfängt Elektronen von den entwicklungsfähigen Zellen und überträgt die Elektronen auf WST-8 im Kulturmedium. Da seine formazan Färbung auch in hohem Grade wasserlöslich ist, kann CCK-8 nicht für das Zellenbeflecken verwendet werden.
4. Beeinflußt Phenolrot die Probe? Nr. Der Absorptionswert des Phenolrotes im Kulturmedium kann gelöscht werden, durch den Absorptionswert einer unbelegten Lösung vom Absorptionswert von jedem gut subtrahieren. Folglich kann der Kulturmedium, der Phenolrot enthält, für die Probe CCK-8 verwendet werden.
5. Gibt es eine Wechselbeziehung zwischen CCK-8 und der Thymidingesellschaftsgründungprobe? Ja. Jedoch beachten Sie bitte, dass, da CCK-8 einen anderen Probenmechanismus von der der Thymidinprobe benutzt, die Resultate sich unterscheiden können. Vergleichsdaten werden im technischen Handbuch gezeigt, das bei www.dojindo.com/tm vorhanden ist.
6. Ist CCK-8 zu den Zellen giftig? CCK-8 Lösung selbst ist wegen der hohen Konzentration von 1-Methoxy PMS cytotoxisch. CCK-8 im Kulturmedium ist jedoch nicht wegen der Verdünnung mit 10mal mit Kulturmedium cytotoxisch. Folglich sind lange Ausbrütung, wie über Nacht und einige Tage, möglich. Die gleiche Zellkultur kann für andere Zellenverbreitungsproben, wie die Kristallveilchenprobe, rote Nullprobe oder DNA-fluorometrische Proben benutzt werden, nachdem die Probe CCK-8 abgeschlossen ist. Da jede Zelle unterschiedliche Toleranz zu CCK-8 hat, brüten Sie Zellen mit Lösung CCK-8 aus und überprüfen Sie die Zellenentwicklungsfähigkeit, wenn eine längere Ausbrütungzeit notwendig ist.
7. Wie ist Stall CCK-8? CCK-8 ist in 6 Monaten bei Zimmertemperatur und einem Jahr bei 0-5 ºC mit Schutz vor Licht beständig. Für längere Lagerung empfehlen wir -20 ºC Speicherzustand; CCK-8 ist in 2 Jahren bei -20 ºC beständig.
8. Ich habe nicht einen 450 Nanometer Filter. Was können andere Filter ich verwenden? Sie können Filter mit der Absorption zwischen 450 Nanometer und 490 Nanometer benutzen.
Referenzen für Zellzählung Kit-8
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