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Qualität erreichend, ist intakte RNS der erste und häufig meiste entscheidende Schritt, wenn sie viele grundlegenden Molekularbiologieexperimente, einschließlich Nordanalyse, Nukleaseschutzproben, RT-PCR durchführt, die abbildende RNS, in-vitroübersetzung und cDNA Bibliotheksaufbau. Zu erfolgreich zu sein jedoch die RNS-Lokalisierungsprozedur sollte einige wichtige Jobstepps beide vor und nach der tatsächlichen RNS-Reinigung einschließen.
Abhängig von der extrahiert zu werden RNS, gibt es Eigenschaften von RNS, die erlauben, dass es weg von anderen zellularen Materialien wie Proteinen, DNA und sogar Lipiden lokalisiert.
Kurier RNS oder mRNA enthält Rückstände eines Ausdehnungsadenosins in Form eines Poly (A) Endstück. Dieses ausgenutzt worden es, um zu erlauben, dass mRNA zu Poly gesprungen (T) Affinitätsspalten oder -korne.
Wenn Sie aktuell eine bevorzugte Methode für die Isolierung von RNS haben, fortfahren Sie e, sie zu benutzen.
Wenn Sie nicht RNS von Ihrem System lokalisiert, bevor und Ihr Organismus nicht auf der folgenden Liste ist, können wir Ihnen helfen, hergestellte Protokolle zu identifizierenen, die für die Isolierung von RNS für das Nordbeflecken oder von RT-PCR von Ihrem System verwendet worden. Diese Typen von Protokollen erbringen auch „Microarraygrad“ RNS.
Laufen lassen Sie immer ein Agarosegel Ihrer RNS, um die Qualität festzusetzen.
ANMERKUNG: Wenn Sie ein nicht Spalte gegründetes Reinigungreagens wie TRIzol benutzen, das wir Sie ausfällen Ihre RNS ein zweites Mal vom Äthanol empfehlen oder, Sie führen es durch eine Rneasy Spalte oder eine ähnliche Einheit. Dieses versichert Abbau aller organischen Verschmutzer (sehen Sie Spektren unten).
Leistungsfähige Kern-/zellplasmatische Fraktionierung kann schnell festgesetzt werden, indem man Agarosegelanalyse denaturiert (siehe Abbildung 1). Die Bänder, die Vorläufer rRNA entsprechen, sollten im Gesamt- und Kern-RNS-Bruch gleichwertig sein. Die rRNA 18S und 28S Bänder sind im Kern-RNS-Bruch als entweder in der Gesamt-RNS oder in der zellplasmatischen Bruch RNS weniger intensiv. In einigen Zellformen z.B. 293 und Zellen COS-7, ist dieser Unterschied drastisch, aber in anderen Zellenzeilen wie Helazellen, sind die rRNA Bänder nur leicht in der Kern-RNS als in der Gesamt- oder zellplasmatischen Bruch RNS weniger intensiv. „
Messwerte A260 und 260/280 Verhältnisse sind nicht genug, zum von hoher Reinheitsgrad RNS sicherzustellen. Sie müssen ein volles UVspektrum nehmen. Sind unten 3 Beispielspektren, denen alle gutes 260/280 Verhältnisse haben, aber haben sehr verschiedene Reinheiten. Sie können das 260/230 Verhältnis auch verwenden, um zu helfen, die Menge der organischen Verschmutzung in Ihrer RNS festzustellen. Es ist eine viel variablere Zahl als das 260/280 Verhältnis, aber im Allgemeinen, anzeigen Verhältnisse über 1 gute Reinheit e.
Zellen gewaschen dann in PBS und extrahierten mehrmals hintereinander, wie beschrieben. Zuerst extrahiert Zellen mit dem Nonidet P-40 Buffer (10 Millimeter Tris-Cl, (pH 7.5), 10 Millimeter NaCl, 3 Millimeter des MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 Millimeter DTT). Die restliche Tablette (rauer Endoplasmanetzmagen (RER) und Kern) gewaschen im gleichen Buffer und extrahiert in Buffer B (10 Millimeter Tris-Cl (pH 7.5), 10 Millimeter NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 Millimeter-EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 Millimeter DTT). Die restliche Kerntablette gewaschen im gleichen Buffer und extrahiert mit hohem Salzbuffer (10 Millimeter Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 m-NaCl, 3 Millimeter des MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 Millimeter DTT). RNS gereinigt von jedem Bruch durch die RNS-Notfall-Lösung. Gesamt-RNS lokalisiert unter Verwendung des Reagens RNA-STAT60 (Telefon-Test) entsprechend den Anweisungen, die vom Hersteller bereitgestellt. (Referenz: Byeong-Churl Jang et al., 2002)
Für 100 mls 200 mls
4. 5M Guanidinium Schwefelcyanat 53.2 EDTA 0.5M g-106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls
0. 1M Bmerkaptoäthanol 700ul 1.4mls
0. 2% Antischaummittel A (Sigma) 200 UL ULs 400
5. 7 M CsCl cushion* abschließender Datenträger 100 ml
5. 7 M „gebackenes“ CsCl 95.8g
0. 1M EDTA 0.5M 20 mls
* Benutzen Sie DEPC behandeltes Wasser und gebackene Glaswaren. Diese Lösung absolut muss RNase positiv frei sein. RNase ist überall! Tragen Sie Handschuhe, gebackene Glaswaren des Gebrauches nur oder reinen Plastik. DePC Festlichkeit Ihr Wasser, Buffer (ausgenommen Tris). Achtgeben Sie sehr ehr.
1. Wiegen Sie Tier. Löschen Sie Organ (Leber), belasten Sie eins der überlegenen Attribute von cDNA ist Sie verringern die Genkompliziertheit, indem Sie ein Organ wählen, das nur einen einzelnen Ort eines multilocus Enzyms ausdrückt. 2. Homogenisieren Sie Gewebe schnell „Chaos“ Buffer (9mls) in der Drehbeschleunigung 3., die bei 12 Kilogramm, um unlösliches Material 4. zu löschen homogenant ist, WÄHREND Homogenant 4A SPINNT. Auslasten Sie 1.8 g von CsCl (0.2g/ml) pro Probe. 4B. Im Ultrazentrifugegefäß („Schnelldichtung“) hinzufügen Sie 3.5mls von 5.7M CsCl „Kissen csCl,“, das diese Schicht RNase frei sein muss. Sie zentrifugieren Ihre RNS durch diese Schicht und jede mögliche Verschmutzung verursacht bedeutende Verluste. 5. Löschen Sie supernant, gesetzt in frisches Gefäß, hinzufügen Sie 1.8 g CsCl 6. sorgfältig ltig, hinzufügen Sie homogenant auf das CsCl Kissen ant. Dieses ist am betriebsbereitesten erreicht, indem es eine Spritze 10cc und eine lange Nadel verwendet. Platzieren Sie Nadel/Spritze in Schnelldichtung Gefäß, und hinzufügen Sie das Gewebe äß, das der Spritze homogenant ist. Homogenant tröpfelt langsam in das Q-S Gefäß und schwimmt auf das Kissen.
7. Sorgfältig abgeglichene Paare der Balance des Zentrifugegefäßes (+-0.005 g).
8. Scheuerschutz, Platz abglich Gefäßentgegengesetztes von einander und von Schutzkappe mit roten Aluminiumoberseiten -.
9. Zentrifuge, 50.000 rpms 5.5 Stunden, 20oC
Nach Zentrifugierung: Markieren Sie Gefäße, in denen Tablette sein sollte: auf der unteren äußeren Seite (im Verhältnis zu Mitte des Rotors)
10. Löschen Sie Gefäße, legen Sie in bequeme Zahnstange.
11. Schneiden Sie weg von der Oberseite des Gefäßes. Ansaugen Sie weg vom Spitzen2/3- 3/4 der Lösung 4. ARBEITEN SIE VON DER OBERSEITE UNTEN. ES IST WICHTIG, DASS SIE WEG VOM OBERLEDER DIE MEISTE LÖSUNG ZUERST ANSAUGEN UND ALLE ABER DAS FREIE KISSEN LÖSCHEN. ANSAUGEN SIE DIE UNSICHTBARE TABLETTE NICHT AN DER UNTERSEITE.
12. Abschneiden Sie das Spitzen2/3 des Gefäßes -. Unter Verwendung eines „gezogenen“ Pasteur pipettieren Sie, löschen Sie sorgfältig restliche Lösung. Die Tablette ist auf dem Bottom-side des Gefäßes.
13. Ausspülen Sie Tablette mit 70% EtOH en, löschen Sie (Gebrauch Pasteur pipettiert), wiederholen Sie zweimal (Gesamtmenge 3 wäscht)
14. Hinzufügen Sie UL 200 von 0.1x TE (die RNase frei), unter Verwendung der pipettierenspitze Zerstampfungtablette und „-titrierung“ des TEE-Versuchs, Tablette in Lösung zu setzen tzen. Bilden Sie mindestens eine heterogene Lösung und setzen Sie in ein frisches microfuge Gefäß.
15. Wiederholen Sie mit UL 200 von TEE beide Lösungen vereinigend
16. Turbulenz, gute RNS mag nicht in Lösung einsteigen. Geduld ist ein Vorzug.
17. Feststellen Sie Konzentration, UL 10 in UL 490 490 (500 UL abschließende Vol.)
18. Löschen 1 bis 2 ug RNS für Gelanalyse (hinzufügen RNS-Ladenbuffer) gen
19. Hinzufügen 1/10 Datenträger RNase frei 3M NaOAC (40 UL), 2.5 Datenträger von EtOH ger (1.0ml). Mischung kräftig.
20. Sie können die Konzentration von RNS im EtOH.Thus berechnen, dort sind keine Notwendigkeit, die ganze Ihre RNS sofort auszufällen. Einfach löschen Sie ungefähr 1.5 bis 2mal die Menge, die Sie benötigen, indem Sie EtOH/RNA Lösung vortexing und löschen Sie den passenden Datenträger. Diese EtOH/RNA Lösung, die an 20oC gespeichert oder, senken, sind für Jahre beständig.
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