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Molekulare Biologie - Wissenschaft Anführungsstriche

Die wenige Abweichung von der Wahrheit wird später multipliziert. ~Aristotle (384-322 BCE) griechischer Philosoph.

Molekulares Biologie-Rundschreiben!

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RNS Lokalisierung

RNS Extraktion-Hintergrundinformationen

Hohe Qualität erreichend, ist intakte RNS die erste und häufig experimentiert der kritischste Jobstep, beim Durchführen viel grundlegende molekulare Biologie, einschließlich Nordanalyse, Nukleaseschutzproben, RT-PCR, die abbildende RNS, in-vitroübersetzung und DNA Bibliothek Aufbau. Erfolgreich zu sein jedoch die RNS-Lokalisierung Prozedur sollte einige wichtige Jobsteps beide vorher und nachher einschließen die tatsächliche RNS-Reinigung.

Grundlegende RNS Lokalisierung Methoden

Abhängig von der extrahiert zu werden RNS, gibt es Eigenschaften von RNS, die erlauben, daß sie weg von anderen zellularen Materialien wie Proteinen, DNA und sogar Lipiden lokalisiert wird.

Kurier RNS oder mRNA enthält Überreste eines Ausdehnung Adenosins in Form eines poly(A) Endstücks. Dieses ist ausgenutzt worden, um zu erlauben, daß mRNA zu den poly(T) Affinität Spalten oder den Kornen gesprungen wird.

Spitzen für RNS Extraktion und Lokalisierung

Wenn Sie aktuell eine bevorzugte Methode für das Lokalisieren von von RNS haben, fahren Sie fort, sie zu benutzen.

Wenn Sie nicht RNS von Ihrem System lokalisiert haben, bevor und Ihr Organismus nicht auf der folgenden Liste ist, können wir Ihnen helfen, hergestellte Protokolle zu kennzeichnen, die für das Lokalisieren von von RNS für das Nordbeflecken oder von von RT-PCR von Ihrem System verwendet worden sind. Diese Typen von Protokollen erbringen auch "Microarraygrad" RNS.

Lassen Sie immer ein Agarosegel Ihrer RNS laufen, um die Qualität festzusetzen.

ANMERKUNG: Wenn Sie ein nicht Spalte gegründetes Reinigungreagens wie TRIzol benutzen, das wir Sie ausfällen Ihre RNS ein zweites Mal vom Äthanol empfehlen oder, Sie führen es durch eine Rneasy Spalte oder eine ähnliche Einheit. Dieses versichert Abbau aller organischen Verschmutzer (sehen Sie Spektren unten).

RNase-Hemmnisse benutzt in der RNS Extraktion und der Lokalisierung

Überprüfung von von von von RNS Lokalisierung Qualität und Quantität

Leistungsfähige nuclear/cytoplasmic Fraktionierung kann durch denaturierende Agarosegelanalyse schnell festgesetzt werden (siehe Abbildung 1). Die Bänder, die Vorläufer rRNA entsprechen, sollten im Gesamt- und Kern-RNS-Bruch gleichwertig sein. Die rRNA 18S und 28S Bänder sind im Kern-RNS-Bruch als entweder in der Gesamt-RNS oder in der zellplasmatischen Bruch RNS weniger intensiv. In einigen Zelle Zeilen z.B. 293 und Zellen COS-7, ist dieser Unterschied drastisch, aber in anderen Zellen Zeilen wie Helazellen, sind die rRNA Bänder nur etwas weniger intensiv in der Kern-RNS als in der Gesamt- oder zellplasmatischen Bruch RNS."

RNS Reinheit

Messwerte A260 und 260/280 Verhältnisse sind nicht genug, zum von von hoher Reinheitsgrad RNS sicherzustellen. Sie müssen ein volles UVSPEKTRUM nehmen. Unter sind 3 Beispielspektren, denen alle gutes 260/280 Verhältnisse haben, aber haben sehr unterschiedliche Reinheiten. Sie können das 260/230 Verhältnis zur Hilfe auch verwenden feststellen die Menge der organischen Verschmutzung in Ihrer RNS. Es ist eine viel variablere Zahl als das 260/280 Verhältnis, aber im Allgemeinen, zeigen Verhältnisse über 1 gute Reinheit an.

Mengenmäßig bestimmen der RNS Extraktion und der Lokalisierung

RNS Lokalisierung von den subzellularen Brüchen

Zellen wurden dann in PBS gewaschen und extrahierten mehrmals hintereinander, wie beschrieben. Zuerst wurden Zellen mit dem Nonidet P-40 Buffer extrahiert (10 Millimeter Tris-Cl, (pH 7.5), 10 Millimeter NaCl, 3 Millimeter MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 Millimeter DTT). Die restliche Tablette (rauher Endoplasmanetzmagen (RER) und Kern) wurde im gleichen Buffer gewaschen und extrahiert in Buffer B (10 Millimeter Tris-Cl (pH 7.5), 10 Millimeter NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 Millimeter EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 Millimeter DTT). Die restliche Kerntablette wurde im gleichen Buffer gewaschen und extrahiert mit hohem Salzbuffer (10 Millimeter Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 3 Millimeter MgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 Millimeter DTT). RNS wurde von jedem Bruch durch die RNS-Notfall Lösung gereinigt. Gesamt-RNS wurde mit dem Reagens RNA-STAT60 (Telefon-Test) entsprechend den Anweisungen lokalisiert, die vom Hersteller bereitgestellt wurden. (Referenz: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

RNS Lokalisierung Mit CsCl Protokoll

Chaos-Buffer für RNS-Lokalisierung

Für 100 mls 200 mls

4. 5M Guanidinium Schwefelcyanat 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls

0. 1M Bmerkaptoäthanol 700ul 1.4mls

0. 2% Antischaummittel A (Sigma) 200 UL 400 UL

5. 7 M CsCl Kissen * abschließender Datenträger 100 ml

5. 7 M "Gebackenes" CsCl 95.8g

0. 1M EDTA 0.5M 20 mls

RNS Extraktion-Prozedur Mit CsCl

* Benutzen Sie DEPC behandeltes Wasser und gebackene Glaswaren. Diese Lösung absolut muß RNase positiv frei sein. RNase ist überall! Tragen Sie Handschuhe, gebackene Glaswaren des Gebrauches nur oder reinen Plastik. DePC Festlichkeit Ihr Wasser, Buffer (ausgenommen Tris). Geben Sie sehr acht.

1. Wiegen Sie Tier. Löschen Sie Organ (Leber), belasten Sie eins der überlegenen Attribute von DNA ist Sie verringern die Genkompliziertheit, indem Sie ein Organ wählen, das nur einen einzelnen Ort eines multilocus Enzyms ausdrückt. 2. Homogenisieren Sie Gewebe schnell "im Chaos" Buffer (9mls) 3. Spinnen Sie homogenant bei 12 Kilogramm, um unlösliches Material 4 zu löschen. WÄHREND Homogenant 4A SPINNT. Lasten Sie 1.8 g von CsCl (0.2g/ml) pro Probe aus. 4B. Im Ultrazentrifugegefäß ("Schnelldichtung") fügen Sie 3.5mls von 5.7M CsCl "Kissen hinzu,", das diese Schicht RNase frei sein muß. Sie zentrifugieren Ihre RNS durch diese Schicht und jede mögliche Verschmutzung verursacht bedeutende Verluste. 5. Löschen Sie supernant, gesetzt in frisches Gefäß, fügen Sie 1.8 g CsCl 6 hinzu. Sorgfältig fügen Sie homogenant auf das CsCl Kissen hinzu. Dieses ist am betriebsbereitesten erreicht, indem es eine Spritze 10cc und eine lange Nadel verwendet. Plazieren Sie needle/syringe in Schnelldichtung Gefäß, und fügen Sie das Gewebe hinzu, das der Spritze homogenant ist. Homogenant tröpfelt langsam in das Q-S Gefäß und schwimmt auf die Oberseite des Kissens.

7. Sorgfältig brachte Balance Paare des Zentrifugegefäßes zusammen (+-0.005 g).

8. Scheuerschutz, Platz brachte Gefäßentgegengesetztes von einander und von Schutzkappe mit roten Aluminiumoberseiten zusammen.

9. Zentrifuge, 50.000 rpms 5.5 Stunden, 20oC

Nach Zentrifugierung: Kennzeichnen Sie Gefäße, in denen Tablette sein sollte: auf der unteren äußeren Seite (im Verhältnis zu Mitte des Rotors)

10. Löschen Sie Gefäße, legen Sie in bequeme Zahnstange.

11. Schneiden Sie weg von der Oberseite von tube.Aspirate weg vom oberen 2/3- 3/4 der Lösung. ARBEITEN SIE VON DER OBERSEITE UNTEN. ES IST WICHTIG, DASS SIE WEG VOM UPPER DIE MEISTE LÖSUNG ZUERST ANSAUGEN UND ALLE ABER DAS FREIE KISSEN LÖSCHEN. SAUGEN SIE DIE UNSICHTBARE TABLETTE NICHT AN DER UNTERSEITE AN.

12. Schneiden Sie das obere 2/3 des Gefäßes ab. Mit einem "gezogenen" Pasteur pipettieren Sie, löschen Sie sorgfältig restliche Lösung. Die Tablette ist auf der Unterseite-Seite des Gefäßes.

13. Spülen Sie Tablette mit 70% EtOH aus, löschen Sie (Gebrauch Pasteur pipettiert), wiederholen Sie zweimal (Gesamtmenge 3 wäscht)

14. Fügen Sie UL 200 von 0.1x TE (die RNase frei) hinzu, das Verwenden pipettieren Spitze, um Tablette und "das Titrieren" des T.E. Versuchs zu zerquetschen, Tablette in Lösung zu setzen. Bilden Sie mindestens eine heterogene Lösung und setzen Sie sich in ein frisches microfuge Gefäß.

15. Wiederholen Sie mit UL 200 von T.E., das beide Lösungen vereinigt

16. Turbulenz, gute RNS mag nicht in Lösung einsteigen. Geduld ist eine Tugend.

17. Stellen Sie Konzentration, UL 10 in UL 490 fest (500 UL abschließendes Vol.)

18. Löschen Sie 1 bis 2 ug RNS für Gelanalyse (fügen Sie RNS-Ladenbuffer hinzu)

19. Fügen Sie 1/10 Datenträger RNase frei 3M NaOAC (UL 40), 2.5 Datenträger von EtOH hinzu (1.0ml). Mischung kräftig.

20. Sie können die Konzentration von RNS im EtOH.Thus errechnen, dort sind keine Notwendigkeit, die ganze Ihre RNS sofort auszufällen. Einfach löschen Sie ungefähr 1.5 bis 2mal die Menge, die Sie benötigen, indem Sie EtOH/RNA Lösung vortexing und löschen Sie den passenden Datenträger. Diese EtOH/RNA Lösung, die an 20oC gespeichert wird oder, senken, sind für Jahre beständig.

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