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Molekulare Biologie Blog

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RNS Gele

Copyright 2007 - Molekulare Station

 

Geschichte von RNS Gel-Elektrophorese

RNS Gele sind für Dekaden benutzt worden, um sich heraus zu trennen und die Qualität von RNS lokalisiert von den Proben qualitativ festzusetzen. Wenn Sie nicht sicher sind, welche RNS Prüfung ist:

AUDIO Hören Sie zu einer ausführlichen RNS Erklärung! und sehen Sie unseren RNS- Enzyklopädie Artikel.

RNS Gel-Elektrophorese - Hintergrundinformationen

Nach Lokalisierung der RNS-Proben, wird die Qualität der lokalisierten RNS-Vorbereitung normalerweise durch Elektrophorese auf einem denaturierenden Agarosegel festgesetzt. Obgleich die Resultate hauptsächlich qualitativ sind, können Sie etwas Informationen über das Ergebnis der RNS außerdem erhalten.

Gele denaturierend, werden verwendet, weil RNS neigt, sich nach sich zu falten und umfangreiche und beständige Sekundärstruktur über die intramolekulare niedrige Paarung zu bilden. Diese Sekundärstruktur von RNS verhindert, daß sie hauptsächlich entsprechend seiner Größe fortzieht.

Überprüfen Sie, ob Sie eine positive Steuerung der RNS auf dem Gel einschließen, im Fall, daß Sie ungewöhnliche Resultate erhalten, die Sie dann feststellen können, ob das Problem mit dem Gel war oder ein Problem mit der RNS war Sie analysieren. Sie können Molekulargewichtmarkierungen der RNS, eine RNS-Probe auch benutzen, die bekannt ist, um intakt zu sein, oder beide, können zu diesem Zweck verwendet werden.

RNS-Gele werden mit dem befleckenden Äthidiumbromid sichtbar gemacht, während Äthidiumbromid zwischen der Sekundärstruktur der RNS-Moleküle einschiebt und erlaubt, daß RNS unter UVLICHT gesehen wird.

RNS wird heraus durch Gel elektrophorese getrennt (normalerweise Agarosegelelektrophorese). Nachdem Sie ein RNS-Gel laufen gelassen haben, können Sie einen Nordfleck mit folgender Übertragung auf Membrane, Hybridation mit Prüfspitze und schließlich Abfragung leiten. Oder einfach (und viel schneller), Fleck für RNS mit Äthidiumbromid oder SYBR (oder ähnliche Färbung -, die als sie besser ist, ist ungiftig und sicherer).

 

Anwendungen der RNS Gele

Da Nordflecken viel langwieriger als RNS-Gele und Echtzeit-PCR durchzuführen sind, werden sie nicht soviel wie RNS-Gele benutzt.

Die RNS-Gelelektrophorese und seine Varianten werden in der molekularen Biologieforschung verwendet:

• entdecken Sie RNS
• Probe für die Qualität von RNS lokalisiert
• lassen Sie allgemeine Ermittlung der RNS-Quantität oder -ergebnisses zu
• Probe für RNS-Verminderung

Nachteile der RNS Gele

Die Nachteile des Verwendens von von RNS-Gelelektrophorese schließt ein:

• RNS-Gele sind nicht sehr quantitativ. Sie können nicht das RNS-Ergebnis genau feststellen oder sogar mit Standards betragen. Radioaktive Methoden wie Beflecken oder Punktnordflecken sind viel genauer.
• Häufig wird Äthidiumbromid benutzt, um die RNS zu entdecken. Äthidiumbromid ist ein biohazard, da es mutagen und giftig ist.
• RNS-Gele lassen eine Schnellanalyse des RNS-Ergebnisses sind jedoch nicht so schnell wie UVSPEKTRALPHOTOMETRIE oder andere Methoden zu.

Vorteile der RNS Gele

Die Vorteile der RNS Gele schließen ein:

• Es ist eine weit geltende Methode
• RNS-Gele sind sehr schnell und einfach durchzuführen
• Sie können für RNS-Qualität innerhalb 1-2 Stunden prüfen
• Wenn Sie SYBR oder einen anderen ungiftigen Fleck (d.h. Sie benutzen nicht Äthidiumbromid), benutzen, sind RNS Gele ziemlich sicher.

RNS Gel-Protokoll

Um die Vollständigkeit Ihrer RNS zu überprüfen sollten Sie eine "Nordfleck- " Analyse tun. Um dieses zu vollenden müssen Sie ein denaturierendes Gel laufen lassen.

Für Mini-Gele zu den Midi-Gelen des RNS-Gebrauches: Bilden Sie 50 mL-100mL

Für Groß-Gele bilden Sie 400 ml.

 

Für das Gel 100mL (am geläufigsten laufen gelassen) müssen Sie 1g von Agarose hinzufügen, um 1% Agaroselösung zu bilden.

 

Laufendes Buffer-Rezept für RNS Gele

Sich vorbereiten:	500mls	750 mls	1.5 Liter
1X E Buffer (50X)-below	10 ml	15 ml	30 ml
0.66M Formaldehyd (1/19 von Vol.)	26.3 ml	39.5 ml	79 ml

RNS, die Reagenzien Denaturiert

400ul von RNS vorbereiten Reagens denaturierend:

Fügen Sie das folgende hinzu:

• 80% Foramide-entionisiertes 300ul
• 3.7 % UL des Formaldehyds 40
• 1X 50X E UL des Buffers 8
• dH2O = 400ul 52ul

50 X E Buffer pro Liter

Fügen Sie hinzu:

• 0.9 M Na2 HPO4 Diabas- 127.8 g
• 0.1M NaH2PO4 einbasischer g 13.8

Protokoll: Jobsteps, wenn ein RNS Gel vorbereitet wird

1. setzen Sie Agarose in Lösungen ein.
2. Erhitzen Sie vorbereitete Lösung in Gewebe-eingesteckter Flasche
3. Lassen Sie kühles zu 60°C
4. Fügen Sie Formaldehyd Gleichgestelltem 0.66M 2.7 ml 4.0 5.3 21.2 hinzu
5. (fügen Sie Äthidiumbromid hinzu, wenn Sie es zur Flasche benutzen)
6. Gießen Sie Gel (in der Haube, wenn möglich).
7. Erhitzen Sie 2 ug RNS an 75°C für 10 Min., dann kühlen Sie schnell ab (dieses läßt RNS einzeln-angeschwemmt denaturieren und bleiben).
8. Fügen Sie hinzu: 2.5 Vol. von RNS Reagens denaturierend
9. Fügen Sie 1/10 Vol. der Ladenfärbung Proben hinzu.
10. Laden Sie Proben auf Agarosegelvertiefungen.
11. Lassen Sie Gel (normalerweise Volt 100V) Stunden lang 30minutes-2 laufen. (Überprüfung RNS, die mit Färbung Markierungen läuft)

Spitzen für RNS Gele

Lassen Sie immer ein Agarosegel Ihrer RNS laufen, um die Qualität festzusetzen. Bauen nicht nur nur UVSPEKTRALPHOTOMETRIERESULTATE.

* Benutzen Sie DEPC behandeltes Wasser und gebackene Glaswaren für alle Jobsteps. Die Buffer müssen RNase frei sein oder Milipore gereinigtes Wasser benutzen, wenn Sie in Anstürme sind. RNase ist überall! Tragen Sie Handschuhe, gebackene Glaswaren des Gebrauches nur oder reinen Plastik. DePC Festlichkeit Ihr Wasser, Buffer (ausgenommen Tris). Geben Sie sehr acht.

 

Fehlersuch-RNS Gele

Wenn Sie aktuell eine bevorzugte Methode für das Laufen lassen von von RNS haben, fahren Sie fort, sie zu benutzen.

Behandeln Sie und Pfostenprobleme oder -fragen über RNS Gele im RNS Protokoll-Forum.

RNS Gel-Referenzen