Fördern Sie,/Machen Sie Bekannt & Binden Sie mit uns & Treten Sie mit uns in Verbindung & Über uns & Helfen Sie uns

Molekulare Biologie Blog

Neue Forum-Pfosten

 

Nordfleck

Copyright 2007 - Molekulare Station

AUDIO Hören Sie zu einer ausführlichen Nordfleck-Erklärung!

Geschichte des Nordbefleckens

Das Nordbeflecken ist eine befleckende Technik der RNS, die 1977 von Alwine et al. an der Stanford Universität (ref:1) entwickelt wurde. Es wurde nach der südlichen Fleck- Technik benannt, die für DNA befleckt, erfunden durch Edwin M. Southern 1975. Westlicher Fleck, eine Methode für das Beflecken für Proteine ist auch ein Spiel auf dem südlichen benennenden Fleck und wurde 1981 benannt (ref:2).

Hintergrundinformationen - Nordfleck-Technik

Nordanalyse trotz seines Alters in der Welt des hohen Tech von Echtzeit-PCR, von Nukleaseschutzproben (RPAs) und von microarrays, ist noch für die Abfragung und die quantitative Bestimmung der mRNA Stufen das Goldstandard. Dieses ist, weil Nordfleckanalyse einen direkten Vergleich des Kurier RNS-Überflußes zwischen Proben auf einer einzelnen Membrane erlaubt.

Im Nordfleck ist der Hauptunterschied zwischen den anderen befleckenden Techniken, daß RNS der Faktor ist, der entdeckt wird. Auch wegen der Tatsache, daß RNS normalerweise einzeln-angeschwemmt wird, erstellt er komplizierte Sekundärstrukturen, die seine Migration beeinflussen und Bedingungen, folglich, denaturierend verwendet werden, die Gele laufen zu lassen (anders als südliches).

RNS wird heraus durch RNA Gelelektrophorese ( normalerweise Agarosegelelektrophorese), folgende Übertragung auf Membrane, Hybridation mit Prüfspitze und schließlich Abfragung getrennt.

 

 

Ähnlich zum südlichen Beflecken, können die Hybridationprüfspitzen DNA oder RNS im Nordbeflecken sein.

Eine Variante der Prozedur, die als der Rücknordfleck bekannt ist, wurde gelegentlich (obgleich, selten) verwendet. In dieser Prozedur ist das Substrat, das Nukleinsäure (das zur Membrane hinzugefügt wird), eine Ansammlung lokalisierte DNA Fragmente und die Prüfspitze ist, die von einem Gewebe extrahierte und radioaktiv beschriftete RNS.

Der Gebrauch von DNA microarrays, die in weitverbreiteten Gebrauch in den späten neunziger Jahren und im frühen 2000s gekommen sind, ist der Rückprozedur, dadurch, daß sie den Gebrauch von den lokalisierten DNA Fragmenten miteinbeziehen, die zu einem Substrat hinzugefügt werden und Hybridation mit einer Prüfspitze entsprechender, die von der zellularen RNS gebildet wird. So die Rückprozedur, obwohl ursprünglich selten, aktiviert der Ein-an-einzeit Studie des Genausdruckes mit Nordanalyse, in den ein Profil erstellenden Genausdruck zu entwickeln, in dem viele (vielleicht alle) der Gene in einem Organismus ihren überwachten Ausdruck haben können

Anwendungen des Nordflecks

Nordflecken sind superceded in den meisten Bereichen durch Echtzeit-PCR und microarray Annäherungen gewesen. Er wird nicht häufig für die klinischen oder Diagnosezwecke verwendet.

Das Nordfleckprotokoll und seine Varianten werden jedoch in der molekularen Biologieforschung verwendet:

• ein Goldstandard für die direkte Studie des Genausdruckes auf der Stufe von mRNA (Kurier RNS-Abschriften).
• Abfragung der mRNA Abschriftgröße
• Studie RNS-Verminderung
• Studie RNSVERBINDEN - kann wechselweise verbundene Abschriften entdecken
• studieren Sie RNS-Halbwertzeit
• Studie IRES (interne ribosomal Eintragsite) - Möglichkeit der RNS-Verdauung gegen 2. cistron Übersetzung löschen.
• verwendete häufig, die transgenic/Knockoutmäuse (Tiere) zu bestätigen und zu überprüfen

Nachteile des Nordbefleckens

Die Nachteile des Verwendens des Nordbefleckens schließen ein:

• Häufig wird Radioaktivität verwendet. Dieses verhindert Mühelosigkeit des Durchführens sie, Gebrauch und Beseitigung. Neue Methoden der inaktiven Abfragung sind festgelegt worden, inaktive Abfragung erlaubend. Sehen Sie Zu durchbohren.
• Der vollständige Prozeß des Nordbefleckens dauert eine lange Zeit normalerweise, von der Beispielvorbereitung durch zur Abfragung.
• Wenn die RNS-Proben etwas vermindert von RNases gleichmäßiges sind, ist die Qualität der Daten und der quantitativen Bestimmung des Ausdruckes ziemlich negativ betroffen.
• Die Standardnordfleckmethode ist verhältnismäßig weniger empfindlich als Nukleaseschutzproben und RT-PCR. Die Empfindlichkeit der Nordflecken kann mit dem Gebrauch der positiv-belasteten Nylonmembranen, Gebrauch von einer in hohem Grade spezifischen antisense Prüfspitze erhöht werden.
• Abfragung mit mehrfachen Prüfspitzen ist ein Problem. Häufig müssen die Membranen vor Hybridation und Abfragung mit einer zweiten Prüfspitze entfernt werden. Dieses ist ein Problem, da rauhe Bedingungen benoetigt werden, um Prüfspitzen vom Fleck abzustreifen und auch zeitraubend sind. Auch es gibt eine Begrenzung zur Zeitmenge, die ein Fleck entfernt werden kann.

Vorteile des Nordbefleckens

Die Vorteile der Nordflecken schließen ein:

• Es ist eine weit geltende und gut betrachtete Methode
• das Nordbeflecken ist eine Geradeausmethode
• Häufig wird es als Bestätigung oder Überprüfung verwendet
• Häufig ein Goldstandard
• es ist ein vielseitiges begabt Protokoll, da es den Verbrauch vieler Typen Prüfspitzen (gegen Echtzeit-PCR) Einschließen erlauben kann: radioaktive und nicht-radioaktive, übertragene IN-VITRORNS und sogar Oligonucleotides wie Zündkapseln.
• Reihenfolgen mit sogar teilweiser Homologie, anders als Echtzeit-PCR oder andere Methoden können als Hybridationprüfspitzen (d.h. Reihenfolge von der unterschiedlichen Sorte für Homologieanalyse oder sogar genomic Fragmente verwendet werden kann verwendet werden).

Nordfleck-Protokoll

Wie erwähnt, schließen die Jobsteps im Nordbeflecken ein:

1. RNS-Lokalisierung
2. Gelelektrophorese von RNS für Trennung
3. Übertragung auf Membrane (wird normalerweise positiv belastetes Nylon als RNS negativ aufgeladen)
4. Vernetzung von RNS zur Membrane (normalerweise durch UV-Querverbinden oder Chemikaliemittel)
5. Hybridation
6. Abfragung

Materialien benötigten für Nordfleck-Protokoll

Buffer-Rezepte

20XSSPE (500 ml)

• 3.6M NaCl: 105.2 g
• 0. 2M Phosphatbuffer pH 7.0: 100mL von 1M
• 20mM EDTA: 20mL von 0.5M

Phosphatbuffer pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (einbasische) 140 ml 1M
• Na2H2PO4 (Diabas-) 360 ml 1M
• pH bis 7.0 nach beiden werden hinzugefügt

Hybridationbuffer = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10%

 

* * Recht, bevor Sie verwenden, fügen Sie 1000ug denaturierte RNase frei CT DNA (Hitze zu 95o, damit 3 Minuten denaturieren), Hefe 5000ug RNS hinzu

 

WÄSCHE: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS = 0.1% SDS

Laufender Buffer für RNS-Gel (1L)

• 100 mls 10X MOPPS
• 52. 6 mls Formaldehyd
• 847. 4 mls H20

RNS Gel (70ml)

• 0.84 g Agarose
• 7 mls 10x MOPPS
• 58.38 mls H2O
• Setzen Sie Gel in gelöster Form durch Heizung. Lassen Sie das Gel, das zu 60°C kühl ist, fügen Sie dann Formaldehyd Gleichgestelltem 0.66M -- 3.78 mls hinzu
• Gießen Sie Gel in der Dampfhaube, wenn möglich

RNS Proben für Nordfleck

Sehen Sie RNS Lokalisierung und Reinigung

RNS Gel

Nachdem man RNS lokalisiert hat, muß die RNS heraus auf einem Gel (normalerweise Agarose) getrennt werden.

sehen Sie RNS-Gele

Nordfleck-Übertragung auf Nylonmembrane Protokoll

Nachdem Sie das RNS- Gel laufen gelassen haben, waschen Sie das Gel mit dem destillierten Wasser, das auf posiblotter gesetzt wird.

Schichten von oben bis unten sind:

• Schwamm
• 3-4 Whatman Papierschnitt zur Größe (beide von diesen oben sollten in 10X SSPE aber Tropfen oben getränkt werden nicht)
• Gelschablone.
• Anmerkung: Stellen die Geltestblätter die Schablone sicher, damit sie Membrane mit Zeile der Oberseite des Gels versiegeln kann und die rechte obere Ecke 3 Stücke etwas grösserer 3M harter Papierplastik mit Bohrungen kennzeichnete

Klemmplatte an und stellen sicher, daß es eine gute Dichtung gibt. Verwenden Sie 75-80 Millimeter Hektogramm Druck 1 Stunde lang oder mehr.

Beflecken Sie die trockene Membrane

Vernetzung Nylonmembranen - Nordfleck-Protokoll

• Schneiden Sie Rechteecke Verpackung in der Saranverpackung.
• UV bestrahlen Sie mit RNS-Seite unten für 2.5 Minuten.
• Waschen Sie für ein Paar von Minuten in der heißen 2X SSPE/0.1% SDS Lösung (Mikrowelle Lösung für 30-45 Sekunden bei der 50% Energie.
• Lüften Sie trockenes

Vor Hybridation für Nordfleck

1. Hybridisieren Sie vor für 6 Stunden-über Nacht
2. Stellen Sie Ofen auf 65°C Buffer der Hitze HB ein, um SDS in gelöster Form zu setzen
3. Rollen Sie oben Membrane innerhalb des Stückes des Ineinandergreifens und setzen Sie sich in hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. Überprüfen Sie auf Luftblasen
5. Setzen Sie Gefäß in den Ofen ein, der mit einem anderen Gefäß auf gegenüberliegende Seite ausgeglichen wird

Beschriftende Prüfspitze für das Nordbeflecken

1. Setzen Sie 25ng der Prüfspitze in einen Gesamtdatenträger 11uL mit ddH2O ein
2. Denaturieren Sie @ 95°C 3 Minuten. Dieses soll der Prüfspitze einzelnes angeschwemmt erhalten und Sekundärstruktur löschen, die leistungsfähige Hybridation verhindern würde.
3. Kühlen Sie schnell auf nassem Eis ab. Dieses soll Prüfspitze einzelne angeschwemmt halten, frei von der Sekundärstruktur und reannealing (oder von den Sekundärstrukturen verbessern nicht dürfen).
4. Fügen Sie radioaktive P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul Gesamtmenge des stark Haupt (Boehringer Mannheim) 5ul Alphas 4ul hinzu
5. Brüten Sie 10-15 minimales 37°C aus
6. Fügen Sie 28uL von 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, Reaktion 20ul hinzu.
7. Vor-spinnen Sie G-25 Sephadex Spalte für 1 Minute.
8. Fügen Sie Probe 50ul Spalte hinzu und spinnen Sie für 2.5 Minuten in der klinischen Zentrifuge. Dieses soll Prüfspitze weg vom Kennsatz reinigen.
9. Des Throw Spalte weg.
10. Mischen Sie in einer neuen Gefäß 100ug CT-DNA 50ug Hefe RNS in einem Gefäß 0.5mL.
11. Denaturieren Sie 95° 3 Minuten
12. Fügen Sie hybrider Gefäßmischung hinzu, hybridisieren Sie an 65°C 20-36 Stunden lang

Geben Sie Hybridation Protokoll für das Nordbeflecken bekannt

Hybridisieren Sie 36-48 Stunden lang waschen dann.

1. Erhitzen Sie herauf 2X SSPE/0.1% SDS (Wäsche) Hitze bis zu 65° C (die Gebrauchmikrowelle oder -wasserbad, zum der Lösung zu wärmen)
2. Nehmen Sie Gefäß heraus und gießen Sie Flüssigkeit in heißen Behälter des radioaktiven Abfalls.
3. Spülen mit Wäsche 10ml tun dies zweimal und gießen Vergeudung heraus.
4. Vigoursly gesetzt in 40 bis 50 mls Wäsche und Erschütterung.
5. Gesetzt in Hybridationofen für minimales Drehen 20.
6. Gießen Sie hinunter Wanne
7. Ein anderes 40-50mls und Erschütterung im Ofen.
8. Gießen Sie heraus zum Abfallbehälter (Wanne, wenn nicht heiß oder giftig) und stellen Sie sicher, daß er nicht mehr heiß ist und dann Membrane herausnimmt.
9. Waschen Sie auf Schüttel-Apparat mit 0.2XSSPE mit 0.1% SDS an Funktelegraphie für 15 Minuten.
10. Lüften Sie trockenes
11. Exposé

 

Spitzen für Nordfleck

Wenn Sie aktuell eine bevorzugte Methode für das Lokalisieren von von RNS haben, fahren Sie fort, sie zu benutzen.

Lassen Sie immer ein Agarosegel Ihrer RNS laufen, um die Qualität festzusetzen. Bauen Sie nicht nur auf Spektralphotometrieresultate.

* Benutzen Sie DEPC behandeltes Wasser und gebackene Glaswaren. Diese Lösung absolut muß RNase positiv frei sein. RNase ist überall! Tragen Sie Handschuhe, gebackene Glaswaren des Gebrauches nur oder reinen Plastik. DePC Festlichkeit Ihr Wasser, Buffer (ausgenommen Tris). Geben Sie sehr acht.

 

Fehlersuchnordflecken

Wenn Sie aktuell eine bevorzugte Methode für das Lokalisieren von von RNS haben, fahren Sie fort, sie zu benutzen.

 

Behandeln Sie und geben Sie Fragen über dieses im Nordfleck-Forumbekannt.

Nordfleck-Referenzen

1. Alwine JC, Kemp DJ, Steifer GR (1977). "Methode für Abfragung von spezifischem RNAs in der Agarose gelatiert durch Übertragung auf Diazobenzyloxymethylpapier und Hybridation mit DNA prüft". Proc. National. Acad. Sci. USA. 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (April 1981). "' westliches Beflecken ': elektrophoretische Übertragung der Proteine von den Natriumdodecylsulfat- — Polyacrylamidgelen auf unveränderte Nitrozellulose und der radiographischen Abfragung mit Antikörper und radioiodinated Protein A ". Anale Biochemie 112 (2): 195-203.