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Nordfleck

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AUDIOhören zu einer ausführlichen Nordfleck-Erklärung!

Geschichte des Nordbefleckens

Das Nordbeflecken ist eine befleckende Technik der RNS, die 1977 von Alwine et al. an der Universität von Stanford entwickelt wurde (Referenz: 1). Es wurde nach der südlichen Flecktechnik benannt, die für DNA befleckt, erfunden von Edwin M., das 1975 südlich ist. Westlicher Fleck, eine Methode für das Beflecken für Proteine ist auch ein Spiel auf dem südlichen benennenden Fleck und wurde 1981 benannt (Referenz: 2).

Hintergrundinformationen - Nordfleck-Technik

Nordanalyse trotz seines Alters in der Hightech- Welt von Echtzeit-PCR, von Nukleaseschutzproben (RPAs) und von Microarrays, ist noch für die Abfragung und die quantitative Bestimmung der mRNA-Stufen das Gold-Standard. Dieses ist, weil Nordfleckanalyse einen direkten Vergleich des Kurier RNS-Überflußes zwischen Proben auf einer einzelnen Membrane erlaubt.

Im Nordfleck ist der Hauptunterschied zwischen den anderen befleckenden Techniken, dass RNS der Faktor ist, der entdeckt wird. Auch wegen der Tatsache, dass RNS normalerweise single-stranded ist, erstellt er komplizierte Sekundärstrukturen, die seine Systemumstellung beeinflussen und Bedingungen, folglich, denaturierend verwendet werden, um die Gele laufen zu lassen (anders als südliches).

RNS wird durch RNAgelelektrophorese (normalerweise Agarosegelelektrophorese), folgende Übertragung auf Membrane, Hybridation mit Prüfspitze und schließlich Abfragung ausgesondert.

Ähnlich dem südlichen Beflecken, können die Hybridationprüfspitzen DNA oder RNS im Nordbeflecken sein.

Eine Variante der Prozedur, die als der Rücknordfleck bekannt ist, wurde gelegentlich (obgleich, selten) verwendet. In dieser Prozedur ist das Substrat, das Nukleinsäure (das zur Membrane hinzugefügt wird), eine Ansammlung lokalisierte DNA-Fragmente und die Prüfspitze ist, die von einem Gewebe extrahierte und radioaktiv beschriftete RNS.

Der Gebrauch von DNAmicroarrays, die weit verbreiteten Gebrauch Ende der Neunzigerjahre und frühen 2000s geerbt haben, ist der Rückprozedur, dadurch, dass sie den Gebrauch von den lokalisierten DNA-Fragmenten miteinbeziehen, die zu einem Substrat hinzugefügt werden und Hybridation mit einer Prüfspitze entsprechender, die von der zellularen RNS gebildet wird. So überwachte die Rückprozedur, obwohl ursprünglich selten, aktiviert der Ein-an-einzeit Studie des Genausdrucks unter Verwendung der Nordanalyse, zum in den ein Profil erstellenden Genausdruck zu entwickeln, in dem viele (vielleicht alle) der Gene in einem Organismus ihren Ausdruck haben können

Anwendungen des Nordflecks

Nordflecken sind in den meisten Bereichen durch Echtzeit-PCR-und Microarrayansätze ersetzt worden. Er ist nicht zu den klinischen oder Diagnosezwecken häufig benutzt.

Das Nordfleckprotokoll und seine Varianten werden jedoch in der Molekularbiologieforschung verwendet:

• ein Gold-Standard für die direkte Studie des Genausdrucks auf dem Niveau von mRNA (Kurier RNS-Abschriften).
• Abfragung der mRNA-Abschriftgröße
• Studie RNS-Verminderung
• Studie RNSverbinden - kann wechselweise verbundene Abschriften entdecken
• studieren Sie RNS-Halbwertzeit
• Studie ZORN (interne ribosomale Eintragsite) - Möglichkeit der RNS-Verdauung gegen 2. Cistronübersetzung löschen.
• häufig benutzt die transgenic/Ausscheidungswettkampfmäuse (Tiere) bestätigen und überprüfen

Nachteile des Nordbefleckens

Die Nachteile der Anwendung des Nordbefleckens umfassen:

• Häufig wird Radioaktivität verwendet. Dieses verhindert Mühelosigkeit der Ausführung sie, Gebrauch und Beseitigung. Neue Methoden der inaktiven Abfragung sind festgelegt worden, inaktive Abfragung erlaubend. Sehen Sie Pierce.
• Der vollständige Prozess des Nordbefleckens nimmt eine lange Zeit normalerweise, von der Beispielvorbereitung durch zur Abfragung.
• Wenn RNS-Proben sogar etwas von RNases vermindert werden, ist die Qualität der Daten und der quantitativen Bestimmung des Ausdrucks ziemlich negativ betroffen.
• Die Standardnordfleckmethode ist verhältnismäßig weniger empfindlich als Nukleaseschutzproben und RT-PCR. Die Empfindlichkeit der Nordflecken kann mit dem Gebrauch der positively-charged Nylonmembranen, Gebrauch von einer in hohem Grade spezifischen antisense Prüfspitze erhöht werden.
• Abfragung mit mehrfachen Prüfspitzen ist ein Problem. Häufig müssen die Membranen vor Hybridation und Abfragung mit einer zweiten Prüfspitze entfernt werden. Dieses ist ein Problem, da raue Bedingungen benötigt werden, um Prüfspitzen vom Fleck abzustreifen und auch Zeit raubend sind. Auch es gibt eine Begrenzung zur Zeitmenge, die ein Fleck entfernt werden kann.

Vorteile des Nordbefleckens

Die Vorteile der Nordflecken umfassen:

• Es ist eine weit geltende und gut betrachtete Methode
• das Nordbeflecken ist eine Geradeausmethode
• Häufig wird es als Bestätigung oder Überprüfung verwendet
• Häufig ein Gold-Standard
• es ist ein vielseitig begabtes Protokoll, da es den Verbrauch vieler Typen Einschließen der Prüfspitzen erlauben kann (gegen Echtzeit-PCR): radioaktive und nicht-radioaktive, übertragene IN-VITRORNS und sogar Oligonucleotides wie Zündkapseln.
• Reihenfolgen mit sogar teilweiser Homologie, anders als Echtzeit-PCR oder andere Methoden können als Hybridationprüfspitzen (d.h. Reihenfolge von der verschiedenen Sorte für Homologieanalyse oder sogar genomic Fragmente angewendet werden kann verwendet werden).

Nordfleck-Protokoll

Wie erwähnt, umfassen die Jobstepps im Nordbeflecken:

1. RNS-Lokalisierung
2. Gelelektrophorese von RNS für Trennung
3. Übertragung auf die Membrane (normalerweise positiv - belastetes Nylon als RNS ist negativ - aufgeladen)
4. Vernetzung von RNS zur Membrane (normalerweise durch UV-Querverbindung oder Chemikalienmittel)
5. Hybridation
6. Abfragung

Materialien brauchten für Nordfleck-Protokoll

Buffer-Rezepte

20XSSPE (500 ml)

• 3.6M NaCl: 105.2 g
• 0. 7.0:100 ml des 2M Phosphatbuffers pH von 1M
• 20mM EDTA: 20mL von 0.5M

Phosphatbuffer pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (einbasische) 140 ml 1M
• Na2H2PO4 (Diabas-) 360 ml 1M
• pH bis 7.0 nach beiden werden hinzugefügt

Hybridationbuffer =HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10%

* *Right, vor der Anwendung, fügen 1000ug denaturierte RNase frei Hefe 5000ug RNS CT-DNA-(Hitze zu 95o, damit Minute 3 denaturiert) hinzu

WÄSCHE: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS= 0.1% SDS

Laufender Buffer für RNS-Gel (1L)

• 100 mls 10X MOPPS
• 52. 6 mls Formaldehyd
• 847. 4 mls H20

RNS Gel (70ml)

• 0.84 g-Agarose
• 7 mls 10x MOPPS
• 58.38 mls H2O
• Setzen Sie Gel in gelöster Form durch Heizung. Lassen Sie das Gel, das zu 60°C kühl ist, dann fügen Sie Formaldehyd, um 0.66M zu entsprechen hinzu --3.78 mls
• Gießen Sie Gel in der Dampfhaube, wenn möglich

RNS Proben für Nordfleck

Sehen Sie RNS Lokalisierung und Reinigung

RNS Gel

Nach der Isolierung von RNS, muss die RNS heraus auf einem Gel (normalerweise Agarose) getrennt werden.

sehen Sie RNS-Gele

Nordfleck-Übertragung auf Nylonmembranen-Protokoll

Nach dem Betrieb des RNS-Gels, waschen Sie das Gel mit dem destillierten Wasser, das auf posiblotter gesetzt wird.

Schichten sind von oben bis unten:

• Schwamm
• 3-4 schnitten Whatman Papiere zurecht (beide oben sollten in 10X SSPE aber Tropfen oben getränkt werden nicht)
• Gelschablone.
• Anmerkung: Stellen Sie die Geltestblätter die Schablone sicher, damit sie Membrane mit Zeile der Oberseite des Gels versiegeln kann und die rechte Spitzenecke 3 Stücke etwas größerer 3M harter Papierplastik mit Löchern markierte

Klemmplatte an und stellen sicher, dass es eine gute Dichtung gibt. Verwenden Sie 75-80 Millimeter Hektogramm Druck für 1 Stunde oder mehr.

Beflecken Sie die trockene Membrane

Vernetzungs-Nylonmembranen - Nordfleck-Protokoll

• Schneiden Sie Rechteeckenverpackung in der Saranverpackung.
• UV bestrahlen Sie mit RNS-Seite unten für 2.5 Min.
• Waschen Sie sich für ein paar Minuten in der heißen 2X SSPE/0.1% SDS Lösung (Mikrowellenlösung für 30-45 Sekunden bei der 50% Energie.
• Lüften Sie trockenes

Vor Hybridation für Nordfleck

1. Hybridisieren Sie vor für 6 Stunden-über Nacht
2. Stellen Sie Ofen auf Hitze 65°C HB-Buffer ein, um SDS in gelöster Form zu setzen
3. Rollen Sie oben Membrane innerhalb des Stückes des Ineinandergreifens und setzen Sie sich in hybridizaton Gefäß (2X SSPE/0.1%SDS)
4. Überprüfen Sie auf Luftblasen
5. Setzen Sie Gefäß in den Ofen ein, der mit einem anderen Gefäß auf gegenüberliegende Seite balanciert wird

Beschriftenprüfspitze für das Nordbeflecken

1. Setzen Sie 25ng der Prüfspitze in einen Gesamtdatenträger 11uL mit ddH2O ein
2. Denaturieren Sie @ 95°C 3 Min. Dieses ist, der Prüfspitze einzelnes angeschwemmt zu erhalten und Sekundärstruktur zu löschen, die leistungsfähige Hybridation verhindern würde.
3. Kühlen Sie schnell auf nassem Eis ab. Dieses ist, einzelne angeschwemmt der Prüfspitze zu halten, frei von der Sekundärstruktur und reannealing (oder von den Sekundärstrukturen verbessern nicht zu dürfen).
4. Fügen Sie hoch Haupt (Boehringer Mannheim) 5ul Alpha radioaktive P-32 dCTP 4ul 3000uCi/mmole 20ul Gesamtmenge hinzu
5. Brüten Sie 10-15 minimales 37°C aus
6. Fügen Sie 28uL von 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, Reaktion 20ul hinzu.
7. Vor-spinnen Sie G-25 Sephadex Spalte für 1 Minute.
8. Fügen Sie Probe 50ul Spalte hinzu und spinnen Sie für Minute 2.5 in der klinischen Zentrifuge. Dieses ist, Prüfspitze weg von Kennsatz zu reinigen.
9. Wegwerfen Spalte.
10. Mischen Sie in einer neuen Gefäß 100ug CT-DNA 50ug Hefe RNS in einem Gefäß 0.5mL.
11. Denaturieren Sie 95° 3 Minute
12. Fügen Sie hybrider Gefäßmischung hinzu, hybridisieren Sie an 65°C für 20-36 Stunden

Geben Sie Hybridation Protokoll für das Nordbeflecken bekannt

Hybridisieren Sie 36-48 Stunden lang dann Washington-.

1. Erhitzen Sie oben 2X SSPE/0.1% SDS (Wäsche) Hitze bis zu 65° C (die Gebrauchmikrowelle oder -wasserbad, zum der Lösung zu wärmen)
2. Nehmen Sie Gefäß heraus und gießen Sie Flüssigkeit in heißen Behälter des radioaktiven Abfalls.
3. Spülen mit Wäsche 10ml tun dies zweimal und gießen Abfall heraus.
4. Vigoursly gesetzt in 40 bis 50 mls Wäsche und Erschütterung.
5. Gesetzt in Hybridationofen für minimales Drehen 20.
6. Gießen Sie hinunter Wanne
7. Ein anderes 40-50mls und Erschütterung im Ofen.
8. Gießen Sie heraus zum Abfallbehälter (Wanne, wenn nicht heiß oder giftig) und stellen Sie sicher, dass er nicht mehr heiß ist und dann Membrane herausnimmt.
9. Waschen Sie sich auf Schüttel-Apparat mit 0.2XSSPE mit 0.1% SDS an Funktelegrafie für 15 Min.
10. Lüften Sie trockenes
11. Exposee

Spitzen für Nordfleck

Wenn Sie aktuell eine bevorzugte Methode für die Isolierung von RNS haben, fahren Sie fort, sie zu benutzen.

Lassen Sie immer ein Agarosegel Ihrer RNS laufen, um die Qualität festzusetzen. Bauen Sie nicht nur auf Spektralphotometrieresultate.

* Benutzen Sie DEPC behandeltes Wasser und gebackene Glaswaren. Diese Lösung absolut muss RNase positiv frei sein. RNase ist überall! Tragen Sie Handschuhe, gebackene Glaswaren des Gebrauches nur oder reinen Plastik. DePC Festlichkeit Ihr Wasser, Buffer (ausgenommen Tris). Geben Sie sehr acht.

Fehlersuchnordflecken

Wenn Sie aktuell eine bevorzugte Methode für die Isolierung von RNS haben, fahren Sie fort, sie zu benutzen.

Behandeln Sie und geben Sie Fragen über dieses im Nordfleck-Forum bekannt.

Nordfleck-Referenzen

1. Alwine JC, Kemp DJ, steifes GR (1977). „Methode für Abfragung von spezifischem RNAs in der Agarose gelatiert durch Übertragung auf Diazobenzyloxymethylpapier und Hybridation mit DNA prüft“. Proc. National. Acad. Sci. USA 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (April 1981). „„Westliches Beflecken“: elektrophoretische Übertragung der Proteine vom Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamidgele zu unveränderter Nitrozellulose und radiografische Abfragung mit Antikörper und radioiodinated Protein A“. Anale Biochemie 112 (2): 195-203.

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