Echtzeit-PCR

Echtzeit-PCR ist ein Typ quantitativer PCR, der die Menge von cDNA oder von mRNA in einer Probe, entweder von einer Bevölkerung der Zellen (Gewebe oder Zellkultur) misst, oder vor kurzem sogar von einer Einzelzelle. Istzeit wird geläufig verwendet, um den Ausdruck mRNA eines Gens festzustellen, und sein Ausdruck ebnet (Exemplarzahl von mRNA) während bestimmter Zustände (wie Behandlung der Zellen mit einer Droge).  Echtzeit-PCR kann verwendet werden, um normale (Steuer) Proben mit den Krankheitproben zu vergleichen und eine Idee hinsichtlich der Ausdruckänderungen geben, die mit Pathogenese eintreten.  Echtzeit-PCR wegen seiner Empfindlichkeit wird auch in der Abfragung der Krankheitserreger im Blut wie Viren verwendet.

Die Entwicklung quantitativen ECHTZEITPCR hat die Veränderlichkeit beseitigt, die traditionsgemäß mit quantitativem PCR verbunden ist, so gewähren
Routine- und zuverlässige quantitative Bestimmung der PCR-Produkte.

Inhaltsverzeichnis

Jeder Zellentyp expressess ein Set mRNA-Moleküle, bekannt als ein transcriptome.  In Erwiderung auf Auslöseimpulse sind Zellen in der Lage, Faktoren wie Proteinenzyme innerhalb der Zelle oben-zu regeln oder unten-zu regeln, indem sie die mRNA-Niveaus dieser Faktoren regeln.  mRNA-Stufen werden nicht immer mit Proteinstufen aufeinander bezogen, also ist irgendeine Vorsicht notwendig, gleichwohl im Allgemeinen mRNA-Stufen lose Proteinstufen entsprechen.  Die mRNA-Niveaus bestimmter Faktoren innerhalb einer Zelle unter Verwendung Echtzeitpcr zu messen ist eine Methode, die Anhaltspunkte hinsichtlich der Mengen dieser Faktoren oder Proteine gibt.

Traditionsgemäß wurden mRNA-Stufen innerhalb der Zelle unter Verwendung des Nordbefleckens gemessen.  Diese Technik wird als ein Gold-Standard im Messen der Stufen des Genausdrucks/mRNA angesehen, während sie radioaktive Prüfspitze benutzt, um die RNS zu beschriften, die dann unter Verwendung eines Szintillationkostenzählers mengenmäßig bestimmt wird, der sehr genaue Messwerte gibt. Das Nordbeflecken, obgleich sehr genau, hatte einige Nachteile einschließlich den Gebrauch von Radioaktivität. Das Nordbeflecken benötigte das genaue Messen von mRNA und Gesamt-RNS von den Zellen extrahierte, um Proben zu vergleichen. Dieses war ein Problem, weil, obgleich Abfragungsmethoden sehr genau waren, Fehler in das Nordbeflecken (oder IN RNS-Punkt/in den befleckenden Schlitz) durch Unterschiede bezüglich der GesamtRNA/mRNA Stufen zwischen Proben (IE-Zellenbehandlungen, verschiedene Gewebe, verschiedene Tiere, etc.) eingeführt werden könnte.  Es benötigte auch verhältnismäßig große Mengen RNS, die viele Zellen benötigten. Vor kurzem sind mRNA-Genquantifikation oder Echtzeitpcr-Methoden verbessert worden und sind einfacher durchzuführen und benötigen nicht den Gebrauch von Radioaktivität.  Forscher haben häufig nur Zugriff zu den kleinen Mengen Zellen besonders auf den Gebieten der Stammzelleforschung und der Primärzellenforschung, und Echtzeitpcr hat es möglich, mRNA-Stufen sogar von eine geringe Anzahl Zellen und kürzlich von sogar Einzelzellen sehr mengenmäßig zu bestimmen gemacht.  Jedoch bildet diese extreme Empfindlichkeit der Echtzeitpcr-Methoden es lebenswichtig, Einerproben vor Verschmutzung zu schützen, die zu falsche Resultate führen würde. Aktuelle Istzeit pcr-Methoden und Systeme auch benötigen nicht das Messen der mRNA-oder cDNA Beispielkonzentrationen, bevor Echtzeitpcr geleitet wird.

Higuchi und al.1, 2 gingen mit der Analyse von PCR-Kinetik voran, indem sie ein System konstruierten, das PCR-Produkte wie entdeckt
sie akkumulieren. Dieses „Echtzeit“ System umfaßt das intercalator Äthidiumbromid in jeder Verstärkungsreaktion,
ein angepasstes thermisches cycler, zum der Proben mit UV-Licht zu bestrahlen und Abfragung der resultierenden Fluoreszenz
mit einer rechnergesteuerten abgekühlten CCD-Kamera. Verstärkung produziert zunehmenmengen von double-stranded
DNA, die Äthidiumbromid bindet, mit dem Ergebnis einer Zunahme der Fluoreszenz. Durch die grafische Darstellung der Zunahme der Fluoreszenz
gegen Schleifezahl produziert das System Verstärkungspläne, die eine komplettere Abbildung von liefern
PCR verarbeiten als prüfenproduktaufspeicherung nach einer örtlich festgelegten Anzahl von Schleifen.