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Echtzeit-PCR

Echtzeit- und quantitatives PCR

Einleitung in ein Echtzeit-PCR

Echtzeit-PCR ist ein Typ quantitatives PCR, das die Menge von DNA oder von mRNA in einer Probe, entweder von einer Bevölkerung der Zellen (Gewebe oder Zellkultur) mißt, oder glätten vor kurzem von einer Einzelzelle. Istzeit wird geläufig verwendet, um den Ausdruck des mRNA eines Gens festzustellen, und sein Ausdruck ebnet (Exemplarzahl von mRNA) während bestimmter Zustände (wie Behandeln der Zellen mit einer Droge).  Echtzeit-PCR kann verwendet werden, um normale (Steuer) Proben mit den Krankheitproben zu vergleichen und eine Idee hinsichtlich der Ausdruck Änderungen geben, die mit Pathogenese eintreten.  Echtzeit-PCR wegen seiner Empfindlichkeit wird auch in der Abfragung der Krankheitserreger im Blut wie Viren verwendet.

Die Entwicklung quantitativen ECHTZEITPCR hat die Veränderlichkeit beseitigt, die traditionsgemäß mit quantitativem PCR verbunden ist, so gewähren
Routine- und zuverlässige quantitative Bestimmung der PCR Produkte.

Inhaltsverzeichnis

Einleitung in ein Echtzeit-PCR

Echtzeit-PCR: Vorteile von Echtzeit-PCR

Geschichte von Echtzeit-PCR

Echtzeit-PCR Systeme vorhanden

Echtzeit-PCR Protokolle

Einheit von Echtzeit-PCR

Echtzeit-PCR: Vorteile von Echtzeit-PCR

Jeder Zelle Typ expressess ein Set mRNA Moleküle, bekannt als ein transcriptome.  In Erwiderung auf Auslöseimpulse können Zellen, Faktoren wie Proteinenzyme innerhalb der Zelle oben-zu regeln oder unten-zu regeln, indem sie die mRNA Stufen dieser Faktoren regeln.  mRNA Stufen werden nicht immer mit Proteinstufen aufeinander bezogen, also ist irgendeine Vorsicht notwendig, gleichwohl im Allgemeinen mRNA Stufen lose Proteinstufen entsprechen.  Die mRNA Stufen bestimmter Faktoren innerhalb einer Zelle zu messen, die Echtzeitpcr verwendet, ist eine Methode, die Anhaltspunkte hinsichtlich der Mengen dieser Faktoren oder Proteine gibt.

Traditionsgemäß wurden mRNA Stufen innerhalb der Zelle mit dem Nordbeflecken gemessen.  Diese Technik wird als ein Goldstandard im Messen der Stufen des Gens expression/mRNA angesehen, während sie radioaktive Prüfspitze benutzt, um die RNS zu beschriften, die dann mit einer Szintillation mengenmäßig bestimmt wird, die sehr genaue Messwerte gebend Gegen ist. Das Nordbeflecken, obgleich sehr genau, hatte einige Nachteile einschließlich den Gebrauch von Radioaktivität. Das Nordbeflecken benötigte das genaue Messen von mRNA und Gesamt-RNS von den Zellen extrahierte, um Proben zu vergleichen. Dieses war ein Problem, weil, obgleich Abfragung Methoden sehr genau waren, Fehler in das Nordbeflecken (oder in die befleckende RNS dot/slot) durch Unterschiede bezüglich der GesamtrNA/mRNA Stufen zwischen Proben (IE Zelle Behandlungen, unterschiedliche Gewebe, unterschiedliche Tiere, etc.) eingeführt werden könnte.  Es benötigte auch verhältnismäßig große Mengen RNS, die viele Zellen benötigten. Vor kurzem sind mRNA Genquantifikation oder Echtzeitpcr Methoden verbessert worden und sind einfacher durchzuführen und benötigen nicht den Gebrauch von Radioaktivität.  Forscher haben häufig nur Zugriff zu etwas Zellen besonders in auffängt von der Stammzelleforschung und von der Primärzelle Forschung, und Echtzeitpcr hat es möglich, mRNA Stufen von gleichmäßigem sehr mengenmäßig zu bestimmen eine geringe Anzahl Zellen und kürzlich sogar Einzelzellen gemacht.  Jedoch bildet diese extreme Empfindlichkeit der Echtzeitpcr Methoden es lebenswichtig, irgendjemandes Proben vor Verschmutzung zu schützen, die zu falsche Resultate führen würde. Aktuelle Echtzeitpcr Methoden und Systeme auch benötigen nicht das Messen mRNA oder DNA Beispielder konzentrationen, bevor Echtzeitpcr geleitet wird.

Geschichte von Echtzeit-PCR

Higuchi und al.1,2 gingen mit der Analyse von PCR Kinetik voran, indem sie ein System konstruierten, das PCR Produkte wie entdeckt
sie akkumulieren. Dieses “Echtzeit” system enthält das intercalator Äthidiumbromid in jeder Verstärkung Reaktion,
ein angepaßtes thermisches cycler, zum der Proben mit UV-Licht zu bestrahlen und Abfragung der resultierenden Fluoreszenz
mit einer rechnergesteuerten abgekühlten CCD Kamera. Verstärkung produziert zunehmende Mengen von double-stranded
DNA, die Äthidiumbromid bindet, resultierend in einer Zunahme der Fluoreszenz. Durch das Plotten der Zunahme der Fluoreszenz
gegen Schleifezahl produziert das System Verstärkung Plots, die eine komplettere Abbildung von liefern
PCR verarbeiten als prüfende Produktaufspeicherung nach einer örtlich festgelegten Anzahl von Schleifen.

Externe Sites: sehen Sie Echtzeit-PCR an Echtzeit-PCR Info!

Referenzen für Echtzeit-PCR

1. Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S. und Griffith, R. 1992. Simultane Verstärkung und Abfragung der spezifischen DNA Reihenfolgen.
Biotechnologie 10:413–417.

2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. und Watson, R. 1993. Kinetisches PCR: Echtzeitüberwachung der DNA Verstärkung Reaktionen.
Biotechnologie 11:1026–1030.

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