Bakteriophagenprotokolle der handhabungs-M13

Eine schnelle Methode, zum der Größe der single-stranded DNA von recombinants M13 zu analysieren. - [Gelesene Analyse des Recombinant Bakteriophages M13 klont Protokoll]

Protokoll beschreibt drei Standardmethoden, um Bakteriophage M13 recombinants zu konstruieren: (1) Verbindung von Einsatz DNA zu einem linearisierten Vektor, vorbereitet durch Spaltung von HF M13 mit einem einzelnen Beschränkungsenzym; (2) unter Verwendung der alkalischen Phosphatase, zum von Selbst-verbindung des linearisierten Vektors und (3) unter Verwendung HFs M13 zu unterdrücken zerspaltet mit zwei Beschränkungsenzymen für Richtungsklonen. - [Gelesenes Klonen in Bakteriophage M13 Vectors Protokoll]

Das Protokoll, das hauptsächlich verwendet wird, um große Vorräte an double-stranded DNA von Belastungen von M13 festzulegen, die routinemäßig als Klonen verwendet werden, vectors. Große Mengen single-stranded DNA von einzelnen recombinant können zu den spezifischen Zwecken erforderlich gelegentlich sein z.B. viele Vorbereitungen einer bestimmten radioaktiven Prüfspitze festzulegen oder viele Site-verwiesenen Durch Mutation entstehende Variationen zu konstruieren. - [Gelesene großräumige Vorbereitung des Single-stranded und Double-stranded Bakteriophage M13 DNA-Protokolls]

Das double-stranded replikative Formular (HF) des Bakteriophages M13 wird von angesteckten Zellen unter Verwendung der Methoden lokalisiert, die denen ähnlich sind, die verwendet werden, um Plasmid DNA zu reinigen. Einige Mikrogramme HF-DNA können von einer Kultur 1-2-ml der angesteckten Zellen lokalisiert werden. - [Gelesene Vorbereitung des Double-stranded (replikatives Formular-) Bakteriophage M13 DNA-Protokolls]

Bakteriophage M13 single-stranded DNA wird aus den Viruspartikeln vorbereitet, die durch angesteckte Zellen in den umgebenden Medium abgesondert werden. Die faserigen Partikel werden durch Niederschlag von einem Hoch-Ionen-stärke Buffer mit Polyäthylenglykol konzentriert. Folgende Extraktion mit Phenol gibt die single-stranded DNA frei, die dann durch Niederschlag mit Äthanol gesammelt wird. Dieses Protokoll wird im Allgemeinen verwendet, um single-stranded DNA von eine geringe Anzahl Isolaten M13 vorzubereiten. - [Gelesene Vorbereitung des Single-stranded Bakteriophage M13 DNA-Protokolls]

Single-stranded Schablonen von Bakteriophage M13 DNA, die 20-30 Rückstände Urazil anstatt des Thymine enthält, werden während des Wachstums des Bakteriophages in einer F Belastung der Escherichia- Colitragenden Veränderungen in den ung und dut Genen festgelegt. Diese DNA wird als Schablone in der Kunkel Methode der oligonucleotide-verwiesenen Mutagenese benutzt (Oligonucleotide-verwiesene Mutagenese von Single-stranded DNA). - [Gelesene Vorbereitung des Urazil-enthaltenen Single-stranded Bakteriophage M13 DNA-Protokolls]

Die Plaketten, die von den Bakteriophagen M13 oder von bakteriellen Kolonien umgewandelt werden durch die Plasmide tragen spezifische Veränderungen gebildet werden, können durch Hybridation, unter Verwendung eines radioaktiven Oligonucleotide entdeckt werden, der ein vollkommenes Duplex mit der Variationreihenfolge bildet. Hybridation wird unter Bedingungen der niedrigen Strenge durchgeführt, die den radioaktiven Oligonucleotide zur Durch Mutation entstehende Variation und zum Wildtypen DNAs tempern lassen. - [Gelesen, Recombinant Klone für Site-verwiesene Mutagenese durch Hybridization zu radioaktivem Oligos rasternd]

Ein synthetischer Oligonucleotide, der zu single-stranded DNA berechnet wird von einem recombinant Bakteriophage M13 oder von der phagemid Schablone getempert wird, wird benutzt, um die Synthese ergänzender radioaktiver DNA vorzubereiten. Synthese wird durch das Klenow Fragment von Escherichia Coli DNA-Polymerase I katalysiert, die die getemperte Zündkapsel für verschiedene Abstände entlang der single-stranded Schablone DNA ausdehnt. - [Gelesene Synthese der Single-stranded DNA-Prüfspitzen der definierten Länge Schablonen-dem Protokoll von des Bakteriophage-M13]

Technik erbringt einer heterogenen Bevölkerung der kurzen radioaktiven Moleküle 200-300 Nukleotide in der Länge. Diese Prüfspitzen werden, wie in der Synthese der Single-stranded DNA-Prüfspitzen der definierten Länge den Schablonen von des Bakteriophage-M13, durch Extension einer Oligonucleotidezündkapsel auf einer single-stranded DNA-Schablone synthetisiert. Die radioaktiven Produkte der Reaktion werden dann von der Schablone durch Elektrophorese durch ein denaturierengel getrennt, von dem sie direkt in Hybridationbuffer eluiert werden. - [Gelesene Synthese der Single-stranded DNA-Prüfspitzen der heterogenen Länge den Schablonen von des Bakteriophage-M13]