Tubulin Polymerisierung-Protokoll unter Verwendung GTP und GMPCPP

Tubulin Polymerisierung-Protokoll unter Verwendung GTP und GMPCPP

Startwert- für Zufallsgeneratoranordnung A.-GMPCPP (sehen Sie Spitze #1)

1. Um kurze GMPCPP Startwerte für Zufallsgenerator zu bilden, mischen Sie unbenanntes Tubulin und beschriftetes Tubulin (1 bis 3 mg/ml Schluss) an einem passenden Verhältnis in 1X BRB80 mit 1 Millimeter DTT und 0.5 bis 1 Millimeter GMPCPP auf Eis.
2. Brüten Sie an 0°C für 5 bis 10 Min. aus.
3. Erklären Sie, indem Sie die Mischung für Minute 5 im Rotor TLA100 bei 90.000 U/min zentrifugieren (360.000 X g) an 2°C.
4. Frieren Sie den Supernatant (CPP Tubulin) in 5 bis 10 μl Aliquoten im flüssigen Stickstoff ein und speichern Sie an -80°C.
5. Übertragen Sie ein Gefäß von CPP Tubulin von der Gefriermaschine auf ein Bad 37°C.
6. Brüten Sie für Minute 15 bis 20 an 37°C. aus.
7. Verdünnen Sie zu μl 150 bis 200 mit warmem BRB80 mit 1 Millimeter DTT.
8. Zentrifugieren Sie die Startwerte für Zufallsgenerator in einem Rotor TLA100 bei 90.000 U/min (360.000 X g) für Minute 5 bei 25 zu 30°C.
9. Verwerfen Sie den Supernatant und setzen Sie die Tablette in 1 bis 2 Datenträgern BRB80 mit 1 Millimeter DTT erneut aus. Dieser Prozess löscht freies CPP und jedes mögliches unpolymerized Tubulin.

B. Erklärung von vorbereitetem Tubulin

1. Mischung unbenanntes Tubulin und beschriftetes Tubulin an einem passenden Verhältnis (1 bis 3 mg/ml Schluss) in 1X BRB80 mit 1 Millimeter DTT und 1 Millimeter GTP auf Eis (sehen Sie Spitzen #2 und #3).
2. Brüten Sie für Minute 5 an 0°C. aus.
3. Zentrifugieren Sie die Mischung für Minute 5 unter Verwendung eines Rotors TLA100 bei 90.000 U/min (360.000 X g) an 2°C.

C. Polymerisierung von Tubulin

1. Sammeln Sie den Supernatant vom Jobstepp #B3 und brüten Sie an 37°C für 1 Min. aus.
2. Fügen Sie einen kleinen Datenträger der GMPCPP Startwerte für Zufallsgenerator hinzu, die in Kapitel Datenträger gebildet werden a-(ungefähr 0.05 bis 0.02) nachdem die Polymerisierungmischung an 37°C für 1 Minute gewesen ist (sehen Sie Spitze #4). Axonemes oder centosomes können als nucleating Strukturen benutzt werden.
3. Setzen Sie Ausbrütung an 37°C. fort. Wenn die Tubulin Konzentration 2 mg/ml oder höher ist, geht Versammlung schnell zur ausgeglichenen Lage über (Minute ungefähr 30). Wenn die Konzentration kleiner als 2 mg/ml ist, kann Kernbildung begrenzen und die exakte Kinetik der Annäherung an ausgeglichene Lage ist schwierig vorauszusagen. In diesem Fall hängt sie von der Menge von aktivem Tubulin in der Mischung ab. (sehen Sie Spitze #5)

Tubulin Polymerisierung-Buffer

1 Millimeter DTT Lösung BRB80 (1X)    (Im Allgemeinen gehalten wie ein Vorrat 5X und bei 4°C) gespeichert 80 Millimeter-ROHRE 1 Millimeter EGTA 1 Millimeter MgCl2 pH 6.8 100 Millimeter GMPCPP 100 Millimeter GTP

Materialien

Spitzen für Protokoll