Genomic DNA Kennzeichnung des Microarrays-Protokolls

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Genomic DNA Kennzeichnung des Microarrays-Protokolls

Datum hinzugefügt: 2. März 2008 08:15: 14 P.M.

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Kategorie: DNAmicroarray-Protokolle

Dieses Protokoll wurde für microarray-gegründete vergleichbare genomic Hybridation entwickelt.

Genomic DNA, die für Microarrays beschriftet, führte im Schrittmodus Protokoll einzeln auf

1. Fügen Sie μg 2 der genomic zu einem hinzu frischen microcentrifuge Gefäß beschriftet zu werden DNA-Probe, (sehen Sie Tipp #1).

2. Fügen Sie TE oder ddH2O einem Gesamtdatenträger μl 21 hinzu.

3. Fügen Sie μl 20 der Mischung der Reaktions-2.5X hinzu.

4. Kochen Sie die Beispielreaktion für 5 Min.

5. Lassen Sie die Reaktion, die auf Eis kühl ist.

6. Fügen Sie μl 5 der dNTP 10X Mischung der Reaktion auf Eis hinzu.

7. Fügen Sie μl 3 von Cy5-dCTP oder von Cy3-dCTP hinzu (sehen Sie Tipp #2) zur Reaktion.

8. Fügen Sie 1 μl Klenow Fragment hinzu (sehen Sie Tipp #3) zur Reaktion.

9. Brüten Sie die Reaktion bei °C 37 1 bis 2 Stunde lang aus.

10. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie μl 5 von 0.5 m-EDTA hinzufügen.

11. Fügen Sie μl 450 von TE der Reaktion hinzu.

12. Platzieren Sie die Reaktionsmischung auf einem Microcon 30™ Filter.

13. Zentrifugieren Sie bei 10.000 X g in einem microcentrifuge für 10 Min.

14. Wandeln Sie die Maßeinheit in ein neues Gefäß und in eine Zentrifuge bei 8.000 für 1 Min. um. Das Eluat sollte ungefähr μl 20 bis 40 sein.

15. Für zwei Farbenreihenhybridationen kombinieren Sie das gereinigte Cy5- und Cy3-labeled prüft in ein frisches microcentrifuge Gefäß.

16. Fügen Sie das folgende hinzu:
   μg 30 bis 50 menschlicher DNA Cot-1 (sehen Sie Tipp #4)
   μg 100 von Hefe tRNA (sehen Sie Tipp #5)
   μg 20 von Poly (DA) - Poly (Papierlösekorotron) (sehen Sie Tipp #6)
   μl 450 von TE 7.4

17. Konzentrieren Sie die Reaktion mit einem Microcon 30™ Filter, wie vorher beschrieben. Überprüfen Sie den Datenträger jede Minute, bis der Datenträger μl 12 oder kleiner ist.

18. Justieren Sie den Datenträger der Prüfspitzenmischung auf μl 12 mit ddH2O.

19. Fügen Sie μl 2.55 von 20X SSC (für eine abschließende Konzentration von 3.4X) und 0.45 μl 10% SDS hinzu (für eine abschließende Konzentration von 0.3%). Der Gesamtdatenträger sollte μl 15 sein, das für Hybridation unter einem 22 Millimeter x 22 Millimeter-Abdeckungbeleg angebracht ist (sehen Sie Tipp #7).

20. Denaturieren Sie die Hybridationmischung, indem Sie sie zu 100°C für 1.5 Min. erhitzen.

21. Brüten Sie die Mischung für Minute 30 an 37°C. aus.

22. Treffen Sie auf die Reihe zu.

23. Hybridisieren Sie den Microarray an 65°C über Nacht (für 16 bis 20 Stunde).

24. Waschen Sie die Reihen, wie folgt:
   Waschen Sie 1:2 X SSC/0.3% SDS für Minute 5 an 65°C
   Waschen Sie 2:1 X SSC für Minute 5 bei Zimmertemperatur
   Waschen Sie 3:0.2 X SSC für Minute 5 bei Zimmertemperatur

25. Scannen Sie die Reihe.

Buffer für die Genomic DNA Kennzeichnung von Microarrays

Poly (DA) - Poly (Papierlösekorotron)		(Sigma) 5 mg/ml Poly (DA) - Poly (Papierlösekorotron)

Hefe tRNA		5 mg/ml Hefe tRNA (Gibco/BRL)

Menschliche DNA Cot-1		1 mg/ml menschliche DNA Cot-1 (Gibco/BRL)

Microcon 30™ Filter		Amicon/Nesselkoralle

Wäsche 3		0.2X SSC

0.5 M-EDTA, pH 8.0

Wäsche 2		1X SSC

Cy5-dCTP oder Cy3-dCTP		(Amersham) 1 Millimeter-Vorrat von Cy5-dCTP oder von Cy3-dCTP

Wäsche 1		0.3% SDS 2X SSC

dNTP 10X Mischung		1.2 Millimeter dTTP 1.2 Millimeter dATP 10 Millimeter Tris 8.0 1 Millimeter-EDTA 0.6 Millimeter dCTP 1.2 Millimeter dGTP

Klenow Fragment		40 bis 50 Units/μl (NEB, Gibco-BRL)

Mischung der Reaktions-2.5X		125 Millimeter Tris, pH 6.8 12.5 Millimeter MgCl2 750 μg/ml gelegentliche octamers 25 Millimeter 2-Mercaptoethanol

10% SDS

20X SSC		3.0 M-NaCl 300 des Millimeter Natriumzitrats (pH 8.0) 0.75 μl 10% SDS

TE		10 Millimeter Tris, pH 7.4 1 Millimeter-EDTA

Materialien benötigt für die Microarray-Kennzeichnung

Tris
Magnesium-Chlorverbindung
SDS
Poly (DA) - Poly (Papierlösekorotron)
Hefe tRNA
Menschliche DNA Cot-1
dCTP
Microcon 30™ Filter
dTTP
Cy3-dCTP
dGTP
dATP
Cy5-dCTP
gelegentliche octamers
EDTA
Klenow
Natriumzitrat
2-Mercaptoethanol

Protokoll-Anmerkungen:

1. Für Hochkompliziertheit DNAs (z.B., menschliche genomic DNA), arbeitet die beschriftenreaktion leistungsfähiger, wenn die Fragmentgröße der DNA zuerst durch Beschränkungsenzymverdauung verringert wird. Nach Verdauung sollte die DNA durch Extraktion mit Phenol/Chloroform und Niederschlag durch Ethanol (sehen Sie Protokoll ID#1453) oder durch den Qiagen PCR-Reinigunginstallationssatz gereinigt werden.

2. CY-dCTP und CY-dUTP arbeiten gleichmäßig gut. Wenn Sie CY-dUTP verwenden, justieren Sie die dNTP 10X Mischung dementsprechend.

3. produziert Hoch-Konzentration Klenow (40 bis 50 Units/μl) besser beschriften.

4. Menschliche DNA Cot-1 blockt Hybridation zu sich wiederholendem DNAs, das auf der Reihe anwesend sein kann

5. Hefe tRNA blockt unspezifische DNA-Hybridation.

6. Poly (DA) - Poly (Papierlösekorotron) blockt die Hybridation zu den polyAendstücken der cDNA Feldelemente.

7. Die Datenträger sollten auf größere Reihen/Abdeckungbelege aufwärts dementsprechend eingestellt werden.

8. Genomic DNA kann mit einem einfachen Gelegentlichschiess-Zündsatz Protokoll beschriftet werden, das auf Gibco/BRL Bioprime DNA-Klebeschildchen-Satz basiert; Nick-Übersetzungsprotokolle können auch verwendet werden. Der Mitwirkende dieses Protokolls benutzt routinemäßig den BioPrime Klebeschildchen-Satz (Gibco/BRL) als bequeme und billige Quelle der gelegentlichen octamers, des Reaktionsbuffers und der Hochkonzentration Klenow (benutzen Sie die dNTP Mischung, die nicht im Installationssatz bereitgestellt wird); andere Quellen der gelegentlichen Zündkapseln und der hohen Konzentration Klenow können auch verwendet werden.

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