Vector Entwurfs-Protokoll für Transgenic Mäuseerzeugung

Vektorentwurfs-Protokoll für Transgenic Mäuseerzeugung

1) Länge des Zielens der Arme

1. Erschienene Studien durch eine Gruppe schlagen vor, dass die minimale Größe für einen zielenden Arm ungefähr 0.5 Kb ist, jedoch diese Größe, die Arm zielt, übereinstimmende Rekombination der sehr niedrigen Leistungsfähigkeit produziert. Die Mitwirkenden dieses Protokolls verwenden im Allgemeinen eine minimale zielende Armlänge auf einer Seite von 1 Kb, mit mindestens Kb 2-3 auf der anderen Seite. Es gibt keinen Grund, warum die zwei zielenden Arme nicht von der gleichen Länge ungefähr sein können. Sie bilden im Allgemeinen beiden zielenden Arme Kb ungefähr 2 an Größe (sehen Sie Tipp #1).

2. Die Mitwirkenden dieses Protokoll häufig PCR, den das Zielen unter Verwendung genomic DNA bewaffnet, die RW-4 (129/SvJ) berechnet wird ES von den Zellen oder von geklonter genomic DNA, wenn sie von einer Quelle 129/SvJ ist (sehen Sie Tipp #2 und #3). Einige PCR-Fehler scheinen, wenige (wenn überhaupt) Probleme für leistungsfähige übereinstimmende Rekombination zu verursachen. PCR bildet zweifellos die Enden von den Fragmenten einfacher, für Einfügung in vektordas enthalten zu manipulieren PGK-Neo.

2) sondern gegen doppelte Auswahl-Techniken aus

1. Das meiste zielende Konstruieren in der Vergangenheit hat PGK-Neo- und HSV-TK verwendet, um eine positive/negative Auswahl durchzuführen. Jedoch ist gancyclovir Behandlung der ES-Zellen durchaus toxische Substanz und die Mitwirkenden dieses Protokolls finden, dass sie negativ die Fähigkeit der ES-Zellen beeinflußt, zu gehen germline. Sie sind bereit, die niedrigere Kinetik der übereinstimmenden Rekombination gegen eine bessere Kinetik der germline Übertragung anzunehmen. Folglich verwenden sie Einzelnauswahl Vektoren mit PGK-Neo ausschließlich. Einige verschiedene Arten PGK-Neokassetten sind vorhanden.

2. Die Mitwirkenden dieses Protokolls sind jetzt routinemäßig unter Verwendung PGK-Neo, das durch Lachs-psites angegrenzt wird, damit die PGK-Neoauswählbare Markierungskassette von CRE-recombinase gelöscht werden kann, um potenzielle Probleme mit zu vermeiden „, Nachbarschaft bewirkt“ von der PGK-Neokassette. Rezente Arbeit von ihrem Labor und andere haben vorgeschlagen, dass dieser Nachbarschaftseffekt im multigene bündelt sehr problematisch ist (sehen Sie Zitieren #1 und #2). Wenn das Gen des Interesses in einem multigene Block ist, müssen Sie die möglichen Nachbarschaftseffekte der beibehaltenen PGK-Neokassetten vorwegnehmen. Lachs-p angegrenzte PGK-Neokassetten und ein Hochleistungs- CRE-recombinase Ausdruckplasmid (pTURBO-CRE) sind vom Mitwirkenden dieses Protokolls vorhanden (sehen Sie Protokoll für Abbau der auswählbaren Markierungs-Kassetten Transfected ES von den Klonen unter Verwendung der Cre-Lachs vermittelten Rekombination).

3) Abfragung der übereinstimmenden Rekombination-Ereignisse

1. Obgleich einige Leute erfolgreich PCR verwendet haben, um übereinstimmende recombinants zu entdecken, empfehlen sich die Mitwirkenden dieses Protokolls gegen diese Praxis. Sie empfehlen stark, dass Sie eine eindeutige Prüfspitze entwickeln, die zum Zielen sich sequenziell ordnet extern ist und sie benutzen, um unter Verwendung der südlichen Analyse zu rastern. Sie macht nicht, ob diese Prüfspitze aufwärts oder vom zielenden Konstruieren stromabwärts gerichtet ist, es ausmacht nur aus, dass sie vollständig extern ist und dass sie keine sich wiederholenden DNA-Elemente enthält.

2. Zusätzlich zum Definieren eines übereinstimmenden Rekombinationbandes, lässt südliche Analyse auch die Einschätzung des molarity der Variationbänder zu, das schwierig, durch PCR zu tun ist. Wenn die Wildtyp und Variationbänder nicht in der Intensität gleich sind, müssen Sie misstrauisch sein, das der gerichtete Klon mit Wildtypen ES-Zellen verschmutzt wird. Wenn er ist, hat der Wildtyp Zellen einen Vorteil, wenn sie in blastocysts eingespritzt werden, und das Resultat ist chimeric Männer, die meistens Wildtypen Goldhasenwelpen werfen. Dieses kann ein sehr großes Problem sein. Wenn die gerichteten Bänder auf dem südlichen korrekt schauen, aber das molarity vermutlich defekt ist, dann empfehlen die Mitwirkenden dieses Protokolls stark, dass die Zellen in G-418 neu gewählt werden oder sogar neu plattiert, indem man Verdünnung zum subclone die ES-Zellen des Interesses begrenzt.

4) Erzeugung der Chimeric Mäuse

1. Es gibt einige Dienstleistungen, die für die Herstellung der chimeric Mäuse von den gerichteten ES-Klonen vorhanden sind (sehen Sie Tipp #4). Handels- und akademische Einspritzung-Dienstleistungen können von erreicht werden „bindet“ Kapitel der Web site des Mitwirkenden.

Protokoll-Spitzen

1. Es kann einen bedeutenden Vorteil geben, wenn man im Wesentlichen länger zielende Arme verwendet; jedoch ist großes Konstruieren schwieriger zu manipulieren. In der Erfahrung der Mitwirkenden erbringt das Zielen der Arme von Kb ungefähr 2 auf jeder Seite übereinstimmende Rekombination-Leistungsfähigkeiten von 1 bis 2%, die zu den meisten Zwecken ausreichend sind.

2. Die embryonale Stammzellform des Mitwirkenden wurde von den blastocysts 129/SvJ lokalisiert und wird RW-4 genannt. Ein neues Papier durch Elizabeth Simpson und Kollegen am Jackson-Labor (sehen Sie, dass Zitieren #3) sorgfältig genetische Variante unter allen 129 substrains ausgewertet hat. Vor dem Beginnen irgendwelcher Experimente die Mitwirkenden, dieses Protokolls empfehlen stark sich dieses Papier zu überprüfen. Die große Vielfalt der embryonalen Stammzellformen, die von den verschiedenen Forschern erreicht werden können, kann innerhalb des Hintergrundes 129 in hohem Grade unterschiedlich sein. Wählen Sie diese Zellformen sorgfältig, da sie nicht ganz gleichwertig sind. Es gibt einige allelic Unterschiede zwischen den 129 substrains, die geringe Histocompatibilityunterschiede verursachen, und es gibt viele Unterschiede bezüglich der Hintergründe der 129 substrains (und sogar in den ES-Zellformen erreicht von diesen Belastungen).

3. Von der Anmerkung eine vorsichtige Auswertung des substrain 129/SvJ (Jackson-Labor #000691), von dem Zellen RW-4 gebildet, keine allelic Unterschiede zwischen den Mäusen und den Zellen RW-4 aufdecken wurden. Folglich sind keine offensichtlichen Veränderungen während der Vorbereitung der Zellform der Mitwirkenden erworben worden.

4. Beachten Sie bitte, dass Sie ein aktives Tierprotokoll haben müssen, das die chimeric Mäuse bedeckt, die Sie auf Datei empfangen werden, bevor Einspritzungen anfangen können.