Koppelungs-Cystein, das Peptide zum Fördermaschine-Protein für Immunisierung und Polyclonal Antikörper enthält

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Koppelungs-Cystein, das Peptide zum Fördermaschine-Protein für Immunisierung und Polyclonal Antikörper enthält

Datum hinzugefügt: 11. April 2008 09:30: 46 P.M.

Autor: plinkadmin

Kategorie: Peptid-Protokolle

Die Peptidreihenfolge muss Cysteinaminosäuren enthalten, damit das querverbindenvertreter leistungsfähig die Peptide zum Fördermaschineprotein (DNA) verbindet. Sobald verbunden, kann das Peptidfördermaschine Proteinparonym in einem Zeitplan der Einspritzungen benutzt werden, um eine immune Antwort in den Kaninchen gegen die Peptidreihenfolge herauszubekommen. 1. Bereiten Sie feine Korne Sephadex-G-25 vor, indem Sie über Nacht sie in 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 bei Zimmertemperatur schwellen (ein 5 ml-Buffer/trockenes Gramm Korne). 2. Waschen Sie das Harz 4mal unter Verwendung 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0. 3. Gießen Sie Sephadex G-25 in einen 130 Millimeter x die 20 Millimeter-Spalte oder ein Äquivalent. 4. Waschen Sie sich mit 15 ml von 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0, um die Spalte abzugleichen und das Harz in die Spalte zu vereinbaren. 5. Fügen Sie das SMCC tropfenweise der DNA-Lösung mit dem Mischen hinzu (sehen Sie Tipp # 2 und #4). 6. Brüten Sie die Mischung bei Zimmertemperatur auf einem drehenden Mischer für 30 Min. 7. hinzufügen μl 200 des Dimethylformamids (DMF) 1 ml von 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 8. auflösen mg 5 des Cystein-enthaltenen Peptids in 0.1 M NaH2PO4 aus, Lösungsformular Jobstepp #7. 9. pH-6.0/DMF ausbrüten bei Zimmertemperatur, bis betriebsbereit zu verbinden. 10. Fügen Sie 1 ml von 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 zum SMCC-RSA Paronym hinzu und mischen Sie gut. 11. Laden Sie das Paronym auf die Spalte Sephadex-G-25. 12. Verwenden Sie 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 als der Spaltebuffer und Gravitationsflußgravitationsfluß, um die 1 ml-Brüche in den 1.5 ml-Gefäßen zu sammeln. 13. Sammeln Sie 12 Gesamt Brüche (sehen Sie Tipp #5). 14. Prüfen Sie jeden Bruch durch Mikrotiter-Platten-Bradford-Probe für Protein unter Verwendung μl ungefähr 2 jedes Bruches (sehen Sie Protokoll auf Protein-Konzentrations-Ermittlung unter Verwendung der Mikrotiter-Platten-Bradford-Probe). 15. Vereinigen Sie die Höchstbrüche des SMCC-RSA Paronyms in ein 15 ml-konisches Gefäß. 16. Fügen Sie die aufgelöste Peptidlösung hinzu (von Jobstepp #9) zum Gefäß. 17. Brüten Sie das Gefäß für 12 bis 16 Stunde bei Zimmertemperatur auf einem drehenden mischenden Rad aus (sehen Sie Tipp #6). 18. Dialysieren Sie das SMCC-DNA-Peptid Paronym für 24 Stunde gegen 1 Liter PBS mit 2 Änderungen Buffer an 4°C. Molekulargewicht des Gebrauches 3.500 schnitt Dialyseschläuche ab. (sehen Sie Tipp #7). 19. Teilen Sie die Probe in 400 μl Aliquoten unter und speichern Sie an -80°C. 20. Um Antikörper zu produzieren, benutzen Sie μl 100 des Fördermaschine-crosslinkerpeptid Paronyms pro Kanincheneinspritzung alle drei Wochen mit Freunds Hilfe (sehen Sie Protokoll für Vorbereitung der Polyclonal Antikörper). 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 0.1 M-Natriumphosphat einbasisch, pH 6.0 PBS (10X) 1.4 M-NaCl pH 7.2 30 Millimeter KCl 20 Millimeter-Kaliumphosphateinbasische (KH2PO4) 40 Millimeter-Natriumphosphatdiabas- (Na2HPO4) Bandmitten Vorbereitet in das μl 150 des Dimethylformamids (DMF) wahlweise freigestellt: entweder bereiten Sie SMCC ODER Bandmitten vor (sehen Sie Tipp #2) 1 mg m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide Ester (Bandmitten) (Pierce,), SMCC Vorbereitet in μl 150 des Dimethylformamids (DMF) (VORSICHT sehen Tipp #3) 1 mg Succinlmidyl 4 [n-Maleimidomethyl-Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) (Pierce) wahlweise freigestellt: entweder bereiten Sie SMCC ODER Bandmitten vor (sehen Sie SchlüssellochLimpet Hemocyanin (KLH) des Tipp-#2) SchlüssellochLimpet Hemocyanin mg-4 wahlweise freigestellt: entweder bereiten Sie DNA ODER KLH vor (sehen Sie den Tipp #1), der in 0.3 ml von 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 aufgelöst wird, dialysiert über Nacht gegen 0.1 M NaH2PO4, Kaninchen-Serum-Albumin pH-6.0 (DNA) Wahlweise freigestellt: entweder bereiten Sie DNA ODER KLH vor (sehen Sie den Tipp #1), der in 0.3 ml von 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 aufgelöst wird, dialysiert über Nacht gegen 0.1 M NaH2PO4, Kaninchen-Serum-Albumin-Kaliumphosphat pH 6.0 mg-4, einbasisches Natriumphosphat, Diabas- Freunds hilfreicher Kaliumchlorverbindungs-Natriumchlorid m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide Ester-SchlüssellochLimpet Hemocyanin Succinlmidyl 4 [n-Maleimidomethyl-Cyclohexane-1-Carboxylate Kaninchen-Serum-Albumin-Natriumphosphat einbasisches Dimethylf…

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