Saure Guanidinium Schwefelcyanat RNS Lokalisierungs-Phenol-Chloroform-Extraktion

Saure Guanidinium Schwefelcyanat RNS Lokalisierungs-Phenol-Chloroform-Extraktion

RNS Lokalisierungs-Methode:

Im Schrittmodus RNS Lokalisierungs-Protokoll

1. Für Kulturzellengebrauch des Säugetier- Gewebes 1 ml Lösung pro 1 x 107 Zellen denaturierend. Für Taufliegezellen wir 1 ml Lösung pro 1 x 108 Zellen denaturierend. Für Embryos oder Gewebe verwenden Sie 1 ml Lösung pro Gewebe mg-denaturierend 100 (sehen Sie Spitze #2).
2.  Homogenisieren Sie das Gewebe oder die Zellkulturzellen unter Verwendung eines Teflon-Glas Homogenisierers oder eines polytron Homogenisierers.
3. Übertragen Sie das Homogenat auf ein 5 ml-Polypropylengefäß.
4. Fügen Sie 0.1 ml 2 m-Natriumazetat hinzu und mischen Sie gänzlich durch Umstellung.
5.  Fügen Sie 1 ml des ddH2O gesättigten Phenols hinzu, mischen Sie gut durch Umstellung, fügen Sie 0.2 ml SEVAG hinzu und mischen Sie gut durch Umstellung.
6.  Brüten Sie die Aufhebung für Minute 15 an 0° zu °C 4 aus (sehen Sie Spitze #3).
7.  Zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 X g an 4°C für Minute 20 (9.000 U/min unter Verwendung eines Rotors SS-34).
8.  Übertragen Sie die obere Phase (wässrig) auf ein frisches Gefäß (sehen Sie Spitze #4).
9.  Fällen Sie die RNS aus, indem Sie 1 ml (1 Datenträger) von Isopropanol 100% (Raumtemperatur) hinzufügen.
10.  Platzieren Sie die Proben an -20°C für 30 Min.
11.  Zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 X g an 4°C für 20 minimal (9.000 U/min unter Verwendung eines Rotors SS-34) und verwerfen Sie den Supernatant.
12. Lösen Sie die RNS-Tablette in 0.3 ml Lösung denaturierend auf und übertragen Sie auf ein ein 1.5 ml microcentrifuge Gefäß.
13.  Zur RNS fällen Sie die RNS wieder aus, indem Sie 0.3 ml von Isopropanol 100% hinzufügen und an -20°C für 30 Min. ausbrüten.
14.  Zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 X g an 4°C für 20 minimal (9.000 U/min unter Verwendung eines Rotors SS-34) und verwerfen Sie den Supernatant.
15. Zur Tablette fügen Sie 1 ml 75% Äthanol hinzu, mischen Sie gut und brüten Sie für Minute 5 bis 10 bei Zimmertemperatur aus.
16.  Zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 X g an 4°C für 20 minimal (9.000 U/min unter Verwendung eines Rotors SS-34) und verwerfen Sie den Supernatant.
17. Setzen Sie die RNS-Tablette im 75% Äthanol bei Zimmertemperatur erneut aus, mischen Sie gut durch Umstellung und brüten Sie bei Zimmertemperatur für zwischen Minute 5 bis 10 bei Zimmertemperatur aus.
18.  Zentrifugieren Sie die Lösung bei 10.000 X g an 4°C für 20 minimal (9.000 U/min unter Verwendung eines Rotors SS-34) und verwerfen Sie den Supernatant.
19.  Trocknen Sie die RNS-Tablette in einer Vakuumzentrifuge für 5 bis 15 Min.
20. Lösen Sie die RNS-Tablette in 50 bis 100 μl ddH2O auf.
21.  Bestimmen Sie die RNS quantitativ, indem Sie die Absorption bei 260 Nanometer (sehen Sie Protokoll auf Quantifikation von RNS), messen und speichern Sie in den Aliquoten an -70°C.

RNS Lokalisierungs-Buffer

ddH2O gesättigtes Phenol		Gleiche Datenträger des Mähdreschers von ddH2O und von Phenol (benutzen Sie nicht neutralisiertes Phenol), in eine braune Glasflasche Benutzen Sie das Phenol Mischen Sie gut und brüten Sie an 4°C über Nacht aus
70% (v/v) Äthanol
75% (v/v) Äthanol
SEVAG		24:1 Chloroform: Isoamyl- Spiritus
2 m-Natriumazetat		Autoklav pH bis 4.0 unter Verwendung der Glazial- Essigsäure
10% Sarkosyl		10% (W/V) N-Lauroylsarcosine Natriumsalz
Denaturierung der Lösung		0.1 M 2-Mercaptoethanol* 0.5% (W/V) N-Lauroylsarcosinate Natriumsalz Schwefelcyanat 4 m-Guanidinium (VORSICHT! sehen Sie Spitze #1) *Add kurz vor Gebrauch 25 des Millimeter Natriumzitrats, pH 7.0
0.75 M-Natriumzitrat

Materialien benötigt für RNS Lokalisierungs-Protokoll

• Natriumzitrat
• Guanidinium Schwefelcyanat
• Sarkosyl
• Isoamyl- Spiritus
• Äthanol
• Natriumazetat
• 2-Mercaptoethanol
• Salzsäure
• Chloroform
• Glazial- Essigsäure
• Phenol

Protokoll-Spitzen

Methoden-Referenzen