Microarray-Protokoll-Vorbereitung von Leuchtstoffdna prüft von menschlichem mRNA

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Microarray-Protokoll-Vorbereitung von Leuchtstoffdna prüft von menschlichem mRNA

Datum hinzugefügt: 2. März 2008 09:00: 14 P.M.

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Kategorie: DNAmicroarray-Protokolle

Hintergrund auf dem Protokoll - Vorbereitung der Leuchtstoffdna-Prüfspitzen von menschlichem mRNA

DNAmicroarrays sind bestellte Reihen DNA-Moleküle, die zu den Genen des Interesses ergänzend sind. Sie werden auf der Reihe durch Roboterausrüstung unter Verwendung eines Objektträgersubstrates beschmutzt. Der Ausdruck der Gene in den Zellen kann auf Microarrays dann festgesetzt werden, indem man cDNA vom mRNA der Zellen des Interesses vorbereitet und die Hybridation des vorbereiteten cDNA zur beschmutzten DNA des Microarray misst. Die Intensität der Fluoreszenz der hybridisierten Prüfspitzen zeigt den Überfluss an den spezifischen Abschriften an und reflektiert folglich die Ausdruckniveaus der spezifischen Gene.

Jobstepp 1 - Microarray-Prüfspitzen-Vorbereitungs-Methode

Beschriften Sie zwei microcentrifuge Gefäße Cy3 und Cy5, beziehungsweise.
Kombinieren Sie das folgende in jedem Gefäß, um die Zündkapsel zu tempern: μg 2 μg von mRNA, 4 eines Regular oder befestigte Zündkapsel Oligopapierlösekorotron, fügen ddH2O einem Gesamtdatenträger μl 10 hinzu.
Hitze zu 65°C für 10 minimal und kühl auf Eis.
Fügen Sie μl 10 der folgenden Reaktionsmischung jeder Reaktion Cy3 und Cy5 hinzu: μl 6.0 μl des Buffers des Strang-5X erstes, 3.0 von 0.1 M DTT, 0.6 μl unbenanntes dNTP, 1 Millimeter Cy3 oder Cy5, μl 2.0 von Hochzeichen II
Brüten Sie an 42°C 1 Stunde lang aus.
Fügen Sie 1 μl SSII (Rücktranscriptase Verstärker) jeder Probe hinzu.
Brüten Sie eine zusätzliche 0.5 bis 1.0 Stunde lang aus.
Fügen Sie μl 15 von 0.1 m-NaOH hinzu, um die RNS zu vermindern.
Brüten Sie an 70°C für 10 Min. aus.
Fügen Sie μl 15 von 0.1 MHCl hinzu, um die Reaktion zu neutralisieren.
Justieren Sie den Datenträger auf μl 400 mit TE.
Kombinieren Sie beide Prüfspitzen in 1 Centricon-30™ Filtrationseinheit.
Wäsche #1: Zentrifuge bei krpm 14 in einem Centricon-30™ Mikro-konzentrator für Minute 7 (sehen Sie Tipp #1).
Wäsche #2: Fügen Sie μl 45 von TE hinzu und zentrifugieren Sie wieder bei krpm 14 in einem Centricon-30™ Mikro-konzentrator für 7 Min.
Wäsche #3: Fügen Sie das folgende hinzu:
μg 450 μl von TE, 20 Feldbett 1 menschlicher DNA, μl 2 μl von 10 μg/μ L von polyA RNS, 2 von tRNA und Zentrifuge an 14k U/min in einem Centricon-30™ Mikro-konzentrator für Minute 7 (sehen Sie Tipp #2).
Konzentrieren Sie sich zu einem Datenträger weniger μl als 10. Dieser Datenträger wird erreicht, wenn die Mitte der Membrane trocken und die Prüfspitzenformulare ein Ring der Flüssigkeit an den Rändern der Membrane ist.
Wandeln Sie das Centricon-30™ in ein neues Gefäß und in eine Zentrifuge kurz bei krpm 14 um, um die Prüfspitze wieder herzustellen.

Buffer für Microarray-Prüfspitzen-Vorbereitung

20X SSC		3.0 M-NaCl 300 des Millimeter Natriumzitrats (pH 8.0) 0.75 μl 10% SDS

TE		10mM Tris 1mM EDTA

tRNA		(Gibco-BRL, #15401-011) 10 μg/μl tRNA

PolyA RNS		10 μg/μl polyA RNS (Sigma, #P9403)

Erst-Strang 5X Buffer		375 Millimeter KCl 250 Millimeter Tris-HCl (pH 8.3) 15mM MgCl2

Menschliche DNA Cot1		(Gibco-BRL)

Unbenannte dNTPs		10 Millimeter dTTP 25 Millimeter dGTP 25 Millimeter dATP 25 Millimeter dCTP

Hochzeichen II		200 Units/μl Hochzeichen II (Gibco-BRL)

1 Millimeter Cy3 oder Cy5		(Amersham)

0.1 M DTT

Befestigtes Oligo Papierlösekorotron		4 μg/μl Oligo Papierlösekorotron 5 ' - TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTV N-3

Oligo-Papierlösekorotron		4 μg/μl Oligo Papierlösekorotron

SSII		RückTranscriptase Verstärker

Protokollmicroarray-Prüfspitzen-beschriftenspitzen u. Tips

1. Kombinieren Sie nicht die Prüfspitzen bis Wäsche 2, wenn Re-reinigung der CY-Färbung fließen-durch gewünscht wird.

2. Die „farbige Prüfspitze“ ist in der centricon Maßeinheit sichtbar, wenn sie konzentriert wird.

3. Gebrauch 12 μl für 22 Millimeter x 22 Millimeter-Reihen.

4. Gebrauch 2.55 μl von 20X SSC und 0.45 μl 10% SDS für 22 Millimeter x 22 Millimeter-Reihen.

5. Wenn Sie den SDS hinzufügen, wischen Sie die Pipettespitze mit den sauberen, behandschuhten Fingern ab, um jeden möglichen Überfluss SDS zu löschen.

6. Gebrauch 12 μl für einen 22 Millimeter x 22 Millimeter-Abdeckungbeleg.

7. Der Raum der Wäsche I und eine der Räume der Wäsche II, wenn jedes eine betriebsbereite Plättchenzahnstange hat.

8. Dieser Jobstepp setzt die Übertragung von SDS von Wäsche I herab, um II. zu waschen.

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