Sondern Sie angeschwemmtes Plasmid DNA-Lokalisierungs-Protokoll aus

Artikel-Details

Protokoll-“ Artikel-Details

Sondern Sie angeschwemmtes Plasmid DNA-Lokalisierungs-Protokoll aus

Datum hinzugefügt: 2. März 2008 07:47: 58 P.M.

Autor: plinkadmin

Kategorie: DNA-Protokolle

Sondern Sie angeschwemmte Plasmid DNA-Lokalisierungs-Protokoll-im Schrittmodus Methode aus

1. Nehmen Sie eine bakterielle Kolonie, die mit phagemid mit Einsatz von DNA des Interesses von einer lbs-Platte umgewandelt wird, die Ampicillin enthält. Benutzen Sie Teil des Impfstoffs, um eine Änderung am Objektprogramm auf einem lbs das Enthalten des Ampicillins überziehen und den Rest verwenden zu lassen, um eine 2 ml-Kultur 2X YT des Mediums zu impfen. Überprüfen Sie, ob eine genügende Menge der Kolonie ihn in den 2X YT Medium bildet.

2. Wachsen Sie die Kultur für 2 bis 3 Stunde, oder bis die Kultur fängt gerade an, trüb zu schauen. Fügen Sie 5 ml eines sehr starken (Bakterium 1 x 1012 pro ml) Vorrats an Helferbakterium hinzu (M13KO7).

3. Wachsen Sie die Kultur für 6 Stunde an 37°C.

4. Fügen Sie 1.5 ml dieser Kultur einem microcentrifuge Gefäß und einer Zentrifuge bei 8.000 U/min in einem microcentrifuge für Minute 10 an 4°C hinzu, um die Zellen zu beizen.

5. Pipettieren Sie das Spitzen1 ml des Supernatant in ein microcentrifuge Gefäß, das μl 500 der 13% STÖPSEL der Lösung enthält (sehen Sie Tipp #2). Mischung leicht.

6. Brüten Sie das Gefäß bei Zimmertemperatur für Minute 15 aus (aber nicht mehr).

7. Zentrifugieren Sie das Gefäß mit voller Geschwindigkeit in einem microcentrifuge für Minute 10 am Ausschuss 4°C. der Supernatant.

8. Zentrifugieren Sie kurz in einem microcentrifuge, um die Restder 13% STÖPSEL Lösung zu senken. Löschen Sie diese Restlösung mit einer langwierigen Pasteur Pipette.

9. Wiederholen Sie Jobstepp #8 einmal, um das abschließende Bit der 13% STÖPSEL der Lösung zu löschen.

10. Setzen Sie die Bakteriophagentablette in μl 100 von TES oder von TE erneut aus.

11. Brüten Sie das Bakterium auf Eis für 10 Min. aus.

12. Turbulenz das Gefäß 3mal.

13. Fügen Sie μl 60 des Phenols und der Turbulenz das Gefäß für sek 30 hinzu.

14. Lassen Sie das Gefäß für 5 minimal und Turbulenz für sek 30 wieder stehen.

15. Zentrifugieren Sie das Gefäß in einem microcentrifuge mit voller Geschwindigkeit für Minute 10 bei Zimmertemperatur.

16. Löschen Sie μl 80 vom wässrigen schwimmenden (die obere Phase) und fügen Sie es einem microfuge Gefäß hinzu, das μl 5 des 3 m-Natriumazetats enthält.

17. Fügen Sie μl 200 des Äthanols und der Turbulenz das Gefäß hinzu.

18. Brüten Sie das Gefäß für Minute 15 bei Zimmertemperatur aus.

19. Beizen Sie den DNA-Niederschlag durch Zentrifugierung in einem microcentrifuge für Minute 10 mit voller Geschwindigkeit an 4°C.

20. Löschen Sie den Supernatant und setzen Sie die DNA-Tablette im 70% Äthanol erneut aus.

21. Repellet die DNA durch Zentrifugierung in einem microcentrifuge für Minute 10 mit voller Geschwindigkeit an 4°C.

22. Löschen Sie das Äthanol und lassen Sie die Tablette trocknen.

23. Setzen Sie die DNA-Tablette in μl 25 von TE erneut aus und speichern Sie sie an -20°C.

24. Überprüfen Sie die Plasmidvorbereitung, indem Sie μl 5 der DNA-Lösung auf einem 0.7% Agarose-Gel bei 100 V laufen lassen (sehen Sie Protokoll auf Elektrophorese von DNA auf Agarose-Gelen).

Sondern Sie angeschwemmte Plasmid DNA-Lokalisierungs-Protokoll-Buffer aus

13% STÖPSEL Lösung		Filtersterilisieren Sie. 13% (W/V) Polyäthylen-Glykol (STÖPSEL) 8000 1.5 M-NaCl

2X YT Medium		5 g/liter NaCl 16 g/liter Trypton 10 g/liter Hefe-Auszug Fügen Sie 900 ml ddH2O hinzu und rütteln Sie, bis die aufgelösten Stoffe sich auflösen. Justieren Sie den pH bis 7.0 mit 5 m-NaOH. Holen Sie den Gesamtdatenträger zu 1 Liter mit ddH2O. Zu entkeimen Autoklav.

Lbs-Platten mit Ampere		15 g/liter Nährboden 5 g/liter NaCl 5 g/liter Hefe-Auszug Wenn kühl, fügen Sie Ampicillin einer abschließenden Konzentration von 40 μg/ml hinzu 1 ml/liter 1 m-NaOH Gießen Sie - Platten, speichern an 4°C Autoklav. 10 g/liter Ttryptone

3 m-Natriumazetat

70% (v/v) Äthanol

Phenol (VORSICHT! sehen Sie Tipp #1)

TES		10 Millimeter NaCl 20 Millimeter Tris-HCl, pH 7.5 0.1 Millimeter-EDTA

TE		10 Millimeter Tris-Cl, pH 8.0 1 Millimeter-EDTA

Reagenzien benötigt
Tris Ampicillin Äthanol EDTA Hefe-Auszug Trypton Bakterium des Helfer-M13KO7 Natriumazetat Polyäthylen-Glykol (STÖPSEL) 8.000 Phenol Natriumchlorid Nährboden Natriumhydroxid

Protokoll-Tips
1. VORSICHT! Diese Substanz ist ein biohazard. Konsultieren Sie MSDS dieses Mittels für korrekte handhabende Anweisungen. 2. Oder fügen Sie μl 300 von 20% STÖPSEL 8000 in 2.5 m-NaCl hinzu.

Bewertungen Sie müssen angemeldet werden, um eine Bewertung zu lassen.
Durchschnittliche Bewertung: (Stimmen 0)

Kommentar

Kein Kommentar schon.

Sie müssen angemeldet werden, um eine Bewertung zu lassen.

Molekulares Station-Menü

Willkommen zur molekularen Station!

Sie müssen registrieren, bevor Sie auf unseren Foren bekannt geben oder unsere hoch entwickelten Funktionen benutzen können. Register jetzt! Sein freies und schnell!

Bereits registriert? LOGON jetzt unten.