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Protein-Kennzeichen-Techniken

Proteine können sein seperated durch 2-D Gel-Elektrophorese und mit Massenspektrometrie gekennzeichnet

Proteingehalt einer Zelle wird geschätzt, um aus Tausenden der unterschiedlichen Typen Proteine zu bestehen
mit Dynamikwerten des Ausdruckes. Die Technologie, die aktuell verwendet wird, bezieht die Wiederherstellung der Proteinbestandteile, Fraktionierung dieser sehr komplizierten Mischung mit ein,
enzymatische Proteolyse jeder getrennten und lokalisierten Sorte, umfangreichen spektrometrischen Massenanalyse und die strukturellen Daten schließlich zusammenbringen festgelegt gegen eine Datenbank der bekannten Proteine oder der vorweggenommenen Genomausdruck Produkte.
Diese Prozedur bezieht einen Ausgangsjobstep mit 1 oder 2-dimensional Elektrophorese mit ein (De). Mit 1-DE werden Proteine auf der Grundlage von molekulare Masse getrennt; die Technik ist reproduzierbar und kann für Proteine in der Massenstrecke kDa 10–300 verwendet werden, aber hat Zerlegung begrenzt.
Für Trennung der komplizierteren Proteinmischungen, ist 2-DE die bevorzugte Methode. Dieses bezieht mit ein, die Proteine first entsprechend ihrer Nettoladung durch einen Jobstep der isoelektrischen Scharfeinstellung und dann, in das zweite Maß, entsprechend ihrer molekularen Masse zu trennen, die NatriumdodecylSulfat-polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) einsetzt die eine hohe Trennung efficiency gibt.
 Massenspektrometrie (MS) ist die Methode der Wahl für das identification
von den getrennten Proteinen und von der 2-DE und Massenspektrometrie
stellen Sie jetzt eine Technologie dar, durch die einiges tausend Proteine getrennt werden können, entdeckt worden und identified auf eine automatisierte Art und Weise.
Proteomics Methodenlehre wird zuerst durch Proteintrennung und -standort durch 2-DE erfolgt, der von der Ausrottung der Proteine des Interesses gefolgt wird, die dann proteolytische Verdauung durchmachen, um eine Mischung der Peptidfragmente zu erbringen. Die Peptide werden durch die Massenspektrometrie analysiert und zuerst verwenden MALDI-MS für molekulare Massenermittlung und Erzeugung einer Peptidmasse fingerprint. Wenn die Datenbank, die gegenwärtig sucht, vieldeutige Resultate erbringt, wird eine zweite Masse spektrometrische Analyse, ESI-MS/MS, verwendet, um Reihenfolge Informationen festzulegen, die für das zwingenderes Datenbanksuchen verwendet wird.
Vom Masse Spektrum, das auf Analyse der Proteinauswahlmischung erhalten wird, können die Peptidmasse Karte oder das Peptid Massenfingerprint d.h. die molekularen Massen der Peptidfragmente, ermittelt werden. Häufig wenn die Aminosäurereihenfolge eindeutiges sufficiently und die Masse ist
die hohe Genauigkeit sufficiently, die Massenkarte kann verwendet werden, um Datenbanken zu suchen 12–15, um das Protein ohne die Notwendigkeit an den weiteren Analysen erfolgreich zu kennzeichnen. Wenn jedoch führt das Datenbanksuchen zu vieldeutige Resultate, dann werden die weiteren MSANALYSEN, den Gebrauch von Tandemmassenspektrometrie (MS/MS) mit einbeziehend, sequentiell auf jedem Peptid in der Mischung aufgenommen, um eine Reihenfolge festzulegen oder der teilweisen Reihenfolge, bekannt als eine Reihenfolge Marke, für diese Peptide. Dieses wird häufig durch den Gebrauch ESI-MS/MS19 erzielt und normalerweise muß ein zusätzlicher purification Jobstep durchgeführt werden, um die Peptide von den Salzen und von den Reinigungsmitteln zu trennen, die Geschenk sein können, die Verminderung des Peptidsignals verursachen.

Weitere Datenbank, welche mit beiden die molekulare Masse des Peptids sucht
und die Reihenfolge Marke Informationen sollten zu eindeutiges Protein identification führen.