Protein-Kennzeichen-Techniken

Proteine können durch 2-D Gel-Elektrophorese getrennt werden und mit Massenspektrometrie identifizierent werden

Proteingehalt einer Zelle wird geschätzt, um Tausenden der verschiedenen Typen aus Proteine zu bestehen
mit Dynamikwerten des Ausdrucks. Die Technologie, die aktuell eingesetzt wird, bezieht die Wiederherstellung der Proteinbestandteile, Fraktionierung dieser sehr komplizierten Mischung mit ein,
enzymatische Proteolyse jeder getrennten und lokalisierten Sorte, umfangreichen spektrometrischen Massenanalyse und die strukturellen Daten schließlich abgleichen festgelegt gegen eine Datenbank der bekannten Proteine oder der vorweggenommenen Genomausdruckprodukte.
Diese Prozedur bezieht einen ersten Schritt unter Verwendung 1 - oder Maßelektrophorese 2 mit ein (De). Unter Verwendung 1-DE werden Proteine auf der Grundlage von molekulare Masse getrennt; die Technik ist reproduzierbar und kann für Proteine in der Massenstrecke kDa 10-300 verwendet werden, aber hat Auflösung begrenzt.
Für Trennung der komplizierteren Proteinmischungen, ist 2-DE die bevorzugte Methode. Dieses bezieht mit ein, die Proteine entsprechend ihrer Nettoladung durch einen Jobstepp der isoelektrischen Scharfeinstellung und dann, in das zweite Maß, entsprechend ihrer molekularen Masse zuerst zu trennen, die Natriumdodecylc$sulfatpolyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) einsetzt die ein hohes Trennung effciency gibt.
 Massenspektrometrie (Mitgliedstaat) ist die Methode der Wahl für das Kennzeichen
von den getrennten Proteinen und von der 2-DE und Massenspektrometrie
stellen Sie jetzt eine Technologie dar, durch die einiges tausend Proteine auf eine automatisierte Art und Weise getrennt werden, entdeckt werden und identifizierent werden können.
Proteomics Methodenlehre wird zuerst durch Proteintrennung und -standort durch 2-DE erfolgt, das von der Ausrottung der Proteine des Interesses gefolgt wird, die dann proteolytische Verdauung durchmachen, um eine Mischung der Peptidfragmente zu erbringen. Die Peptide werden durch Massenspektrometrie, zuerst unter Verwendung MALDI-MS für Ermittlung der molekularen Masse und Erzeugung eines Peptidmassenfingerabdruckes analysiert. Wenn die Datenbank, die gegenwärtig sucht, vieldeutige Resultate erbringt, wird eine spektrometrische Analyse der zweiten Masse, ESI-MS/MS, verwendet, um Reihenfolgeninformationen festzulegen, die für das zwingenderes Datenbanksuchen verwendet wird.
Vom Massenspektrum, das auf Analyse der Proteinauswahlmischung erhalten wird, können die Peptidmassenkarte oder der Peptidmassenfingerabdruck d.h. die molekularen Massen der Peptidfragmente, ermittelt werden. Häufig wenn die Aminosäurereihenfolge suffciently eindeutig und die Masse ist
Genauigkeit suffciently hoch, die Massenkarte kann verwendet werden, um Datenbanken zu suchen 12-15, um das Protein ohne die Notwendigkeit an den weiteren Analysen erfolgreich zu identifizierenen. Wenn jedoch führt das Datenbanksuchen zu vieldeutige Resultate, dann werden die weiteren Mitgliedstaat-Analysen, den Gebrauch von Tandemmassenspektrometrie (MS/MS) mit einbeziehend, sequenziell auf jedem Peptid in der Mischung aufgenommen, um eine Reihenfolge festzulegen oder der teilweisen Reihenfolge, bekannt als eine Reihenfolgenmarke, für diese Peptide. Dieses wird häufig unter Anwendung von ESI-MS/MS19 erzielt und normalerweise muss ein zusätzlicher Reinigungjobstep durchgeführt werden, um die Peptide von den Salzen und von den Reinigungsmitteln zu trennen, die Geschenk sein können, die Verminderung des Peptidsignals verursachen.

Weitere Datenbank, welche mit beiden die molekulare Masse des Peptids sucht
und die Reihenfolgenmarkeninformationen sollten zu eindeutiges Proteinkennzeichen führen.