Fördern Sie,/Machen Sie Bekannt & Binden Sie mit uns & Treten Sie mit uns in Verbindung & Über uns & Helfen Sie uns

Molekulare Biologie Blog

Neue Forum-Pfosten

 

2-D Zweidimensionale Gel-Elektrophorese

Die zweidimensionale Gelelektrophorese (auch genannt abgekürzt als 2-D Elektrophorese oder 2-DE) ist eine Methode von Gelelektrophorese, die geläufig verwendet wird, um sehr ähnliches in der Größe zu trennen oder zu analysieren und auch viele Proteine wie das komplette Set der Proteine, die in einer gegebenen Zelle sofort Zeit, das proteome vorhanden sind.

2-D Gelelektrophorese trennt die Proteine in zwei Maßen, im isoelektrischen Punkt und in der Masse. Dieses erlaubt die Trennung der Proteine, die nicht auf Gelen 1-D, einschließlich ähnlich sortierte Proteine und viele Proteine anders getrennt werden oder unterschieden werden konnten (wie ein proteome).

2-D Gel-Inhaltsverzeichnis

• 2-D Gel-Elektrophorese-Hintergrund
• 2-D Gel-Artikel
• Trennung durch Isoelectric Point
• Zweidimensionale Gel-Elektrophorese-Befleckende Methoden
• 2-D Gel-Elektrophorese-Protokoll
• Andere 2-D Gel-Elektrophorese-Protokolle
• Fehlersuch2-D Gele
• 2-D Gel-Elektrophorese-Forum (Sie können jede mögliche Frage über 2-D hier stellen! Verbinden Sie auch die Postsendungliste, um bis zu den Tagesfragen und -antworten auf 2-D Gelen von anderen Wissenschaft Forschern und Experten zu empfangen!)

Zweidimensionaler Gel-Elektrophorese-Hintergrund

Elektrophorese aller zellularen Proteine durch ein SDS-Gel kann die Proteine jedoch trennen, die verhältnismäßig große Unterschiede im Molekulargewicht haben, es kann nicht die Proteine betriebsbereit beheben, die ähnliche Gewichte haben (z.B. ein Protein 53-kDA von einem Protein 52-kDA).

In der 1D Gel-Elektrophoresemethode werden die Proteine in einem Maß getrennt (das sie werden getrennt durch nur Masse ist).

In der 2-D Elektrophorese fängt die Trennung mit Elektrophorese 1-D jedoch dort ist eine zweite Trennung, die stattfindet an und trennt die Proteine durch Ladung in einer Richtung 90 Grad von der ersten.

Das Resultat ist, daß die Parameter heraus über einer zweidimensionalen Oberfläche anstatt entlang einer Zeile verbritten werden. So wegen der Tatsache, daß Proteine durch nicht nur Massen aber auch durch Ladung getrennt werden, ist es unwahrscheinlich, daß es mehr als ein Protein bei einem gibt, das Punkt auf dem 2-D Gel gegeben wird. Dieses ist, weil es unwahrscheinlich ist, daß zwei Proteine nicht nur die gleiche genaue Masse aber auch dieselbe Ladung teilen würden.

Folglich auf einem 2-D Gel, werden Parameter effektiv in der 2-D Elektrophorese als in der Elektrophorese 1-D wegen des zweiten Trennungjobsteps durch Ladung getrennt.

Die 2-D Gel-Trennung-Methode durch Isoelectric Point

Um Proteine einer ähnlichen Masse zu trennen, muß eine andere körperliche Eigenschaft der Proteine verwendet werden. Eine andere wichtige körperliche Proteineigenschaft, die in der Trennung benutzt werden kann, ist elektrische Ladung, die durch die Zahl säurehaltigen und grundlegenden Überresten in einem Protein und in ihrer Gruppe Ladung festgestellt wird.

Zwei ohne Bezugproteine, die ähnliche Massen haben, sind unwahrscheinlich, identische Nettoladungen zu haben, weil ihre Aminosäurereihenfolge unterschiedlich sein würde und folglich die Ladung und die Zahl säurehaltigen und grundlegenden Überresten eine andere Nettoladung geben würden. Dieses würde erlauben, daß diese Proteine durch 2-D, aber nicht durch Elektrophorese des Gels 1-D getrennt werden.

In der 2-D Geltrennungmethode werden Proteine wirklich durch isoelektrischen Punkt getrennt (isoelektrischer Punkt (PU) ist der pH, an dem ein bestimmtes Molekül oder eine Oberfläche keine elektrische Nettoladung trägt).

Eine pH Steigung wird an einem Gel angewendet und ein elektrisches Potential wird über dem Gel angewendet und bildet ein Ende positiver als das andere. An allem pHs aother als ihr isoelektrischer Punkt, werden Proteine aufgeladen. Wenn sie positiv aufgeladen werden, werden sie in Richtung zum negativeren Ende des Gels gezogen und wenn sie negativ aufgeladen werden, werden sie zum positiveren Ende des Gels gezogen. Sobald sie die Region des Gels mit pH erreichen, der ihrem isoelektrischen Punkt jedoch entspricht werden sie neutraly aufgeladen und bleiben in diesem Punkt.

2-D Gel-Elektrophorese-Befleckende Methoden

Protein-Abfragung Protokolle für zweidimensionale Elektrophorese

Nach Trennung werden die Proteine heraus auf dem 2-D Gel getrennt, gleichwohl zum blanken Auge unsichtbar seien Sie. Um die Proteine auf dem Gel sichtbar zu machen, müssen sehr empfindliche Beflecken und Abfragungsmethoden der Proteine durchgeführt werden.

Dieses liegt an einigen Tatsachen:

1. Die Gelwege können einen bestimmten Datenträger von Zelle lysate oder von Proteinlösung nur annehmen.
2. Obgleich das lysate/solution ausgefällt werden und konzentriert werden kann, um mehr Protein zu laden, normalerweise wird weniger Protein auf dem 2D Gel geladen, während übermäßige Proteinmengen es schwierig, das Gel wegen der großen Punktgrößen zu analysieren bilden.
3. Die Trennung einer großen Menge Proteins (mgs) oder sogar die Tausenden der unterschiedlichen Proteine von einem kleinen Weg, in ein verhältnismäßig großes dimensionsional zwei Gel legt Punkte der Proteine fest, die sehr niedriges abudance/Konzentration sind (ng oder picograms!) das sind unmöglich oder schwierig, durch gewöhnliche Flecke oder Proteinabfragung Methoden zu entdecken.
4. Ein niedriger Überfluß/kopiert niedrig Zahlprotein kann getrennt werden, aber kann möglicherweise nicht an der Tatsache entdecktes sogar liegen, daß die empfindlichsten Flecke nur eine Nachweisgrenze auf ein ungefähr 1/2 ein nanogram haben. Picogram Punktstufen sind aktuell sehr schwierig oder unmöglich, mit dem Beflecken zu entdecken.

In der 2D Elektrophorese werden sehr empfindliche Flecke folglich benoetigt. Diese Proteine können durch eine Vielzahl von Mitteln dann entdeckt werden, aber das geläufigste ist Silber Beflecken und coomasiefleck.

Silberne Befleckende 2D Gele

Im silbernen Beflecken des 2-D Gels wird ein silbernes Kolloid am Gel aufgetragen. Das Silber bindet zu den Cysteinegruppen innerhalb des Proteins ab. Das Silber wird dann durch Aussetzung zum UVLICHT verdunkelt. Die Schwärzung des Silbers im Punkt, kann mit der Menge des Silbers und folglich der Menge des Proteins an einem gegebenen Standort auf dem Gel zusammenhängen. Diese Messen-Dose geben nur ungefähre Mengen, aber sind zu den meisten Zwecken ausreichend.

Coomasie Beflecken der 2D Gele

Coomassie Färbung bindet an Proteine über physisorption an Aminosäuren wie die aromatischen Aminosäuren, die Arginin und das Histidin. Coomasie wird auch in der Bradford Methode verwendet. Empfindliche ungiftige coomasie Flecke sind festgelegt worden, die Sichtbarmachung der Punkte erlauben, die weniger als 1 ng Protein enthalten.

SYPRO Beflecken der 2D Gele

SYPRO RUBIN ist ein sehr empfindlicher 2D Proteinabfragung Methode Fleck und erlaubt Sichtbarmachung von ungefähr 1/2 ein ng Protein an einem gegebenen Punkt. Der Nachteil ist die Methode benötigt UVLICHT, den Fleck sichtbar zu machen und so benötigt den Verbrauch eines UVLICHTES. Dieses bildet Ausschnitt von den Punkten schwieriges und möglicherweise gefährliches wegen der möglichen UVBERÜHRUNG.

 

2-D Gel-Elektrophorese-Protokoll

Ein zweidimensionales Gelelektrophoreseprotokoll für 7 Zentimeter IPG entfernt Amersham GE das Erfassen.

2D Gel-Beispielvorbereitung

• Proteinproben normalerweise müssen entsalzt sein oder dialysierten. Dialyse kann mit großen Dialysebeuteln für große Datenträger geleitet werden, oder die Mini schieben-ein-lyzer (durchbohren Sie), für kleine Datenträger.
• Dialyse wurde mit 1 L des 0.3mM Ammoniumbicarbonats über 30 Minuten geleitet, die das Verwenden Dialyseinstallationssätze schieben-ein-lyzer (durchbohren Sie).
• Nach Dialyse wurden Proben mit einem Lyophilisator für 1 ½ lyophilisiert; Stunden.
• Lyophilisierte Proben wurden dann mit 400 L Rehydrierungbuffer wieder hergestellt.

 

IEF Isoelektrische Scharfeinstellung

Jobstep 1. Rehydrierung der IPG Streifen

• Das isoelectrofocusing Tellersegment der drystrip Rehydrierung wurde sorgfältig mit IPGphor Reinigung Lösung gesäubert (erfassendes Amersham GE).
• Stellen Sie sicher, daß das Tellersegment trockenes nicht nasses ist, da Probe entlang die Wasserführungen fortzieht.
• Pipettieren Sie 125 L auf den kreisförmigen Bereich des Tellersegmentes.
• Mit Pinzette löschen Sie sorgfältig IPG Streifen vom Plastikschutz.
• Irgendein IPG Streifen haben ein Plastikcoversheet oder entfernen das Schützen der Gelseite. Löschen Sie diese verwendende Zange/Pinzette, bevor Sie diese Streifen verwenden.
• Legen Sie leicht die Streifengelseite unten auf die Probe nieder.
• Löschen Sie alle mögliche Luftblasen.
• Legen Sie am Ende des Tellersegmentweg Mineralöls nieder und stellen Sie Sie Stoß sicher, den er den Weg niederwirft, bis er vollständig den IPG Streifen umfaßt. Bilden Sie sicher die Mineralöltestblätter der Ganzstreifen, wie dieses Verdampfung während der Rehydrierungjobsteps verhindert.

 

 

Proteomics Haupt	Proteomic Führt Molekulare Station Protokoll	Proteomic Protokolle (externe Links)	Proteomic Bioinformatics	Proteomic FAQ	Proteomic Installationssätze und Produkte	Proteomic Forum	Proteomics Blog	Bücher auf Proteomics	Proteomic Nachrichten