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Westlicher Fleck

AUDIO: Hören Sie zu einer ausführlichen westlichen Fleck-Erklärung! Höflichkeit: Nationales Menschliches Genom-Forschungsinstitut.

Westliche Fleck-Definition: Das westliche Beflecken ist eine Technik, die verwendet wird, um die Proteine zu kennzeichnen und zu lokalisieren, die auf ihrer Fähigkeit, an spezifische Antikörper zu binden basieren.

   Westliche Fleckanalyse kann Ihr Protein des Interesses von einer Mischung vieler Proteine entdecken.  Das westliche Beflecken kann Ihnen Informationen über die Größe Ihres Proteins geben (mit Vergleich zu einer Größe Markierung oder eine Strichleiter im kDa) und gibt Ihnen Informationen über Proteinausdruck auch (mit Vergleich zu einer Steuerung wie unbehandelter Probe oder ein anderer Zelle Typ oder Gewebe). 

Zusammenfassung: Westlicher Fleck gibt Ihnen Informationen über:

Größe Ihres Proteins

Ausdruck Menge Ihres Proteins

Westliche Fleckanalyse kann jede mögliche Proteinprobe analysieren, ob von den Zellen oder von den Geweben, aber die recombinant Proteine auch analysieren kann, die in vitro synthetisiert werden. Westlicher Fleck ist von der Qualität des Antikörpers, den Sie pflegen, für Ihr Protein des Interesses zu prüfen abhängig und wie Besondere es für dieses Protein ist. Antikörper sind jetzt leicht von den kommerziellen Quellen erreichbar, und Sie können ein für Ihr Protein des Interesses kaufen. Wenn Ihr Protein ein Romanprotein ist, müssen Sie einen Antikörper produzieren sich oder eine Firma veranlassen, sie für Sie zu tun. In diesem Fall benötigen Sie mindestens etwas Ihres Proteins entweder, das von den Zelle Extrakten gereinigt wird oder als recombinant gebildet ist (IE in-vitro- oder in einem recombinant Proteinausdruck System).   Die Antikörper, die zu Ihrem Protein spezifisch sind, sind zum westlichen Beflecken lebenswichtig, da sie können, an Ihr Protein des Interesses anstelle von den Tausenden der Proteine auf Ihrem westlichen Fleck spezifisch zu binden!

Abbildung 1. Details der Jobsteps mit einbezogen, wenn Protein für westlichen Fleck erhalten wird.

  Abbildung 2. Stellen Sie das Genau schildern der Jobsteps dar, wenn Sie einen westlichen Fleck leiten.

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Wie Arbeitet Das Westliche Beflecken?

Sehen Sie Diagramm 1 unten. Erste Sachen erste. Erhalten Sie eine Proteinprobe, die Sie analysieren möchten, wie Zelle Proben. Lösen Sie die Zellen auf, um Proteingehalt freizugeben. Lassen Sie diese auf einem Gel laufen, das Proteine auf der Grundlage von Größe trennt. Übertragen Sie dann diese Gelproteine auf eine Membrane mit Elektrizität. Diese Membrane kann dann benutzt werden, um für Proteine des Interesses mit einem Primärantikörper zu prüfen.

Was Sie westlichen Fleck benötigen:

Eine Protein-Probe

Ein guter Antikörper, zum Ihres Proteins des Interesses zu entdecken

Westlicher Fleck beruht auf dem Primärantikörper, um dieses Protein von den Tausenden der Proteine auf Ihrer Membrane und vorher auf Ihrem Gel zu entdecken! (eine Zelle kann 30.000 unterschiedliche Proteine enthalten - und diese gleichen Proteine können sogar geändert werden, Sie über 300.000 unterschiedlichen Proteinen gebend!). Das Verwenden eines Antikörpers erkennt Ihren Primärantikörper (einen Sekundärantikörper), das Sie ein Protein-Antikörper-Antikörper Sandwich aufbauen!  Der Sekundärantikörper hat ein Meerrettich-Peroxydaseenzym, das ein luminol Substrat in eine helle freigebende Substanz umwandelt! Dieses Licht wird als Punkt auf Film entdeckt. Von diesem Punkt können Sie feststellen, wieviel Protein dort im Verhältnis zu anderen Punkten ist oder die Größe des Proteins im Verhältnis zu einer Größe Markierung, die auch auf das Gel laufen gelassen wird.

Diagramm 2 zeigt ein westliches Fleckbeispielgel. Weg 1 ist eine Proteingröße Markierung Strichleiter, die unterschiedliche bekannte Größen der Proteine zeigt, dieses kann kommerziell gekauft werden und die Größen aller Punkte werden in einer Flugschrift gegeben. Weg 3 ist eine Krebsprobe und Weg 5 ist eine normale Probe. Wie Sie sehen können, hat das Protein in Weg 3 einen höheren Ausdruck als die Krebsprobe in Weg 5, der interessant ist. Auch die Proteinpunkte in Wegen 3 und 5 sind die gleiche Größe, die der 2. Punkt in der Größe Strichleiter von Weg 1. Wir können die bekannte Proteingröße von unserer Broschüre dann betrachten, die wir mit der Strichleiter empfingen. Wir stellen dann fest, daß die Größe des Proteins kDa 80 ist. Unser Protein des Interesses ist auch kDa 80. So wissen wir, daß der westliche Fleck arbeitete und daß das Protein in hohem Grade in einer Krebsprobe ausgedrückt wird!

Ihr Protein entdecken:

Kaufen Sie einen Antikörper gegen Ihre Primärantikörper-Quelle

Verwenden Sie eine Ausführungssteuersprache - Chemolumineszenz-Installationssatz und Film, um die Resultate zu erhalten

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Diagramm 1.                                                                                                                                      Diagramm 2.

Erlernen Sie jetzt, daß alles sonst dort über westliche Flecken ist!

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Inhaltsverzeichnis, in der Ordnung erfolgt für westlichen Fleck:

Jobsteps im westlichen Beflecken:

- vorbereitend für westlichen Fleck

- das für westliche Flecken zu verwenden Antikörper,

- Auflösen der Zellen für westlichen Fleck

- SDS-PAGE Gel-Informationen

- SDS-PAGE Gel-Vorbereitung für westliche Flecken

- Gel-Elektrophorese - Laufen lassen des Gels

- Tranfer der Proteine zur Membrane für das westliche Beflecken

- Westlicher Fleck

Bezeichnungen und Definitionen verwendet in der westlichen Fleck-Analyse

Neueste Westliche Fleck-Themen!

 

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Jobsteps in der westlichen Fleck-Analyse:

- Probe Prepartation

- Auflösen Des Buffers

- Antikörper

- Auflösen Der Zellen

- Gel-Vorbereitung

- Laufendes Gel

- Übertragung des Gels

- Kontrollen

- Westlicher Fleck

- Ablesen

- Analyse und Deutung

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Proben für westlichen Fleck vorbereiten:

Ob Sie Nicht-anhaftende Zellen (wie T-Zelle Zeilen oder Zusatzblutzellen) oder anhaftende Zellen (wie Fibroblastzellen oder LATTICH Zellen) haben, müssen Sie äußere Proteine von den Media löschen. Für nicht-anhaftende Zellen können Sie sie mit Zentrifugierung leicht beizen und die Tablette mit PBS dann waschen. Für anhaftende Zellen, einfache Wäsche die Flasche oder Teller mit PBS vor westlichem Fleck.

 

Westliche Fleckanalyse überprüft Proteine und also wünschen wir die Proteine Freigabe von den Zellen sein und auch verhindern, daß die Proteine oben durch Proteasen geschnitten. Wir benötigen diese zum westlichen Fleck:

- Sachen kalt halten! 4C auf Eis während des Zelle Lysis für das westliche Beflecken

- benutzen Sie Reinigungsmittel, um Membranen der Zellen oben zu brechen, um Proteine freizugeben

- Buffer

- Hemmnisse (Proteasehemmnisse und Phosphatasehemmnisse, wenn wir westlichen Fleck für Phosphoproteine tun)

 

Reinigend - Auflösen Der Zellen Für Westlichen Fleck

Sds und RIPA sind Reinigungsmittel, die benutzt werden, um Proteine für neuere Analyse mit dem westlichen Beflecken zu solubilisieren. Diesem wird bis zu Proteine sind entweder innerhalb der Zelle oder lokalisierten inneren der Zelle Membranen benoetigt, also müssen wir diese Proteine freigeben, um zum immunoblot für sie in der Lage zuSEIN.

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Welchen Antikörper sollte ich für das westliche Beflecken benutzen?

Sie sollten einen Antikörper auswählen, um für westlichen Fleck zu verwenden. Normalerweise entweder Mäusemonoclonal Antikörper oder Kaninchen polyclonal Antikörper werden benutzt.

Sie können entweder einen Antikörper ohne irgendwelche hinzugefügten Gruppen benutzen, oder benutzen Sie einen Antikörper, der zum Biotin konjugiert wird. Diese Antikörper benötigen nicht

 

Polyclonal gegen Monoclonal Antikörper für westlichen Fleck

Monoclonal Antikörper sind normalerweise für das westliche Beflecken passend zu besser:

- besseres Geräuschabstand (untererer Hintergrund im westlichen Fleck)

- ihre höhere Besonderheit (Sie erhalten weniger verschmutzende Proteine oder Ig)

- gesamte Reinigungsmittelauswirkungen auf den westlichen befleckenden Film (weniger unspezifische Bänder entdeckt)

 

Polyclonal Antikörper werden besser für Immunopräzipitation entsprochen:

- sie erkennen mehr epitopes

- haben Sie höheres avidity

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Auflösen der Zellen für westlichen Fleck:

SPITZEN vor Ihnen lösen für das westliche Beflecken auf:

Wenn Sie zum westlichen Fleck für Proteinmasse gehen (IE ein Protein, das nicht) phosphoryliert ist:

- Sie können in den größeren Datenträgern auflösen (den Rest halten, um für andere Proteine zu beflecken)

 

Wenn Sie zum westlichen Fleck ein Phosphoprotein gehen (oder phosphoryliertes Protein) ist es wichtig, das folgende zu tun:

- stellen Sie Gebrauchphosphatasehemmnisse sicher (wie vanadate, weil Phosphatasen die Phosphate von Ihren Proteinen löschen! )

- lösen Sie auch Zellen im kleinsten möglichen Datenträger auf (IE lösen im UL 100 Ladenbuffer, dieser wird getan auf, weil Sie die meisten Zellen laden können, die Sie auflösten. Dieses ist, Signal ziemlich schwach so wichtig auch ist, wenn das westliche Beflecken für Phosphoproteine.)

 

Wenn Sie Protein-Protein Interaktionen betrachten:

- verwenden Sie nicht SDS, wie es Protein-Protein Interaktionen trennt und folglich Proteine denaturiert werden (besonders nachdem dem Kochen)

- für westliche befleckende Protein-Protein Interaktionen, IE gebürtige Interaktionen müssen Sie ein weniger-zwingendes Reinigungsmittel benutzen solches RIPA.

 

Auflösen:

- kann direkt auf der Platte oder dem Teller getan werden

- beizen Sie die Zellen

- halten Sie auf Eis und Kälte - benutzen Sie eine Eiswanne

- ungefährer Richtwert, damit, wieviel Lysisbuffer verwendet ist: Zellen 10^5/ul des Lysisbuffers

- sammeln Sie in den eppendorf Gefäßen und dem Kennsatz (halten Sie diese auf Eis)

 

Messen Sie Gesamtprotein vor westlicher Fleck-Analyse:

- dieses erlaubt quantitativere Analyse, wenn Sie Behandlungbedingungen in der westlichen Fleckanalyse vergleichen möchten

- kommerzielle Installationssätze sind wie eine Bradford Probe für das Messen des Gesamtproteins vorhanden (von Bio-Rad)

- 0.1% von SDS oder von grösserer Dose behinderen Proteinmessen

 

Denaturieren Sie Protein-Proben:

- fügen Sie Proteinladenbeispielbuffer einer Aliquote Zelle lysate hinzu - enthält Färbung (sehen Sie auch die Migration auf einem Gel, 2% SDS)

- fügen Sie Reduktionsmittel des Disulfids wie Beta - Merkaptoäthanol hinzu

- Blutgeschwür im Wasserbad- oder Heizungsblock (niedrigere Temperaturen wie mittleres - 90 Grad verringern Proteinanhäufung).

- stoßen Sie eine Bohrung in der Schutzkappe jedes Gefäßes, um Knallen zu verhindern

 

SDS-PAGE Gel-Informationen für das westliche Beflecken

SDS-PAGE Gele sind Gelmatrizen, die benutzt werden, um Proteine durch Größe in Anwesenheit des elektrischen Stromes zu trennen. Niedrige Prozentsatzgele trennen größere Proteine, während höhere Prozentsatzgele kleinere Proteine besser trennen. Das Problem ist, daß alle Proteine aufgeladen verbundenes mit ihnen haben, und in einem elektrischen Strom könnte dieses Probleme verursachen. Dieses wird durch die Hinzufügung von SDS zu den Proteinproben gelöst. Sds bindet an Proteine jede wenigen Aminosäuren und neutralisiert die Ladung Unterschiede, die Proteine haben. Dieses erlaubt, daß Proteine durch Größe und nicht durch Ladung getrennt werden.

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SDS-PAGE Gel-Vorbereitung für westlichen Fleck

- abhängig von wieviel Protein Sie für das westliche Beflecken laden wünschen, sollten Sie kleine Kämme oder größere Kämme benutzen.

- der Prozentsatz des Acrylamids ist wichtig. Der normalerweise 10% Acrylamid wird benutzt.

- ein behebendes Gel wird an der Unterseite mit einem pH von 8.8 benutzt

- ein stapelndes Gel (4-5%) pH 6.8 wird benutzt, um Proteine innen zu packen zusammen, nachdem man geladen hat

- Polymerisierung der Gele wird durch die Katalysatoren APS und TEMED erhöht, die die Polymerisierungreaktion (Anordnung und Verfestigung) des Polyacrylamidgels beschleunigen.

- laden Sie jede Probe sorgfältig und, die Probe langsam zu verhindern, die aus dem Weg heraus ausläuft.

- laden Sie jeden Weg und benutzen Sie Beispielbuffer in jedem (Unterschiede innen verhindern).

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Gelatieren Sie Elektrophorese

1. Zentrifugieren Sie Proben für 10 sek, nachdem Sie gekocht haben.
2. Laden Sie Probe in jeden Weg
3. Laden Sie MW Referenz
4. Lassen Sie Gel an 100V (konstante Spannung) laufen oder sogar verbessern Sie bei 40 MA (konstanter Strom). Überwachen Sie Protein marker/ladder oder färben Sie Frontseite, damit wann Gel stoppen. Konstanter Strom gibt die besseren und schärferen Resultate, wenn Sie die Zeit haben.

- Uhr für Luftblasen zwischen Glas und unter dem Gel - dieses bedeutet, daß es funktioniert

- Uhr für Proteinmigration (sollte unten gehen) - wenn nicht Sie die Leitungen geschaltet und alle Ihre Proben haben verlieren können!

- laufen Sie zuerst langsam durch das stapelnde Gel (~ 50 Volt), dieses gibt schärfere Bänder.

- laufen Sie nicht über Nacht

- überhitzen Sie nicht das Gel (dieses veranläßt das Gel, Starrheit zu verlieren und führt zu die resoloving Armen und die blurry falsch gebildeten Bänder)

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Tranfer der Proteine zur Membrane für das westliche Beflecken

Wählen Sie Membrane Typen Aus:

Kann irgendein verwenden:

- PVDF Membrane für westliche Flecken

- Nitrozellulosemembrane für westliche Flecken

- Nylonmembrane (selten jetzt benutzt - kann heftig zerreißen)

 

Spitzen für Transfering zur westlichen Membrane:

- Abnutzung Handschuhe ständig! Benutzen Sie Zange

- beschränken Sie touching/forceps auf die Membrane

 

Ordnung des Übergangs Bio-Rad:

(-)
Schwamm auf Schwarzem
Filterpapier
Gelnitrozellulose
Filterpapier
Schwamm
(+)

Übertragung :

- halten Sie kühl in 4C

- Übertragung über Nacht bei 35 V

- kann in 1 Stunde an höherem V schnell übertragen

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Westlicher Fleck

Das Blocken der Membranen erlaubt Ihnen, signal:noise Verhältnis zu maximieren

- Abnutzung Handschuhe

- Block mit 5% Blotto (fettfreie trockene Milch - Puder) oder 1 - 5% BSA (Tier-Serum-Albumin) für phosphorylierte Proteine.

- Buffer ist TBST

Waschen Nach Dem Blocken

- das Waschen, nach dem Blocken von von Jobsteps, ist nicht, da Block der Leute häufig während der Primärantikörperausbrütungen kritisch.

- Reinigung ist normalerweise mit TBST Buffer erfolgt. Kann mit einem großen Datenträger TBST schnell getan werden.

Ausbrütung mit Primärantikörper

- Maus, Kaninchen oder andere Sorte

- normalerweise 1: Verdünnung 1000 mit TBST

- wenn hohe background/many unspezifische Bänder ein Problem ist, können Ausbrütungen mit 5% BSA oder Milch erfolgt werden.

Waschen nach Primärantikörper

- nicht so kritisch

- kann mit großen Datenträgern TBST schnell waschen

Ausbrütung des Sekundärantikörpers

- normalerweise verdünntes 1: 10. 000 mit TBST

- Anti-Maus, Anti-Kaninchen oder anderer Antikörper konjugierten mit HRP Enzym für Abfragung

Waschen Nach Sekundärantikörper

- KRITISCH

- Wäsche 5 X für 5 Minuten mit TBST.

- wenn Sie wirklich hetzen müssen, mindestens 3mal mit größeren Datenträgern TBST waschen.

Prüfen für Resultate

- normalerweise wird Ausführungssteuersprache (erhöhte Chemolumineszenz) verwendet

- Film wird herausgestellt und entwickelt. Berührung für 10 Sekunden ist normalerweise genug für Gesamtprotein. Phosphoproteine können 2 - 20 minuziöse Berührungen benötigen.

- Film ist normalerweise XOMAT oder ähnlicher ' schneller ' Film

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Sehen Sie Westlichen Fehlersuchfleck

Bezeichnungen verwendet im westlichen Beflecken:

WB - westlicher Fleck

IB - immunoblot (eine andere Bezeichnung für das westliche Beflecken)

Sds - Natriumdodecylsulfat (ein Reinigungsmittel benutzt in vielen westlichen befleckenden Lösungen)

SEITE - Polyacrilamide Gel-Elektrophorese

AB - Antikörper (Antikörper werden benutzt, um Ihr Protein des Interesses zu entdecken)

HRP - Meerrettich-Peroxydase

Luminol - Substrat, das HRP zerspaltet, um zu verursachen heller Anordnung

Ausführungssteuersprache - erhöhte Chemolumineszenz (westliche Flecklösung, der helle Anordnung von HRP + Luminol erhöht)

kD/kDa - kilodalton (der meiste Proteindurchschnitt zwischen kDa 30 - 80)

RAM - Kaninchen Anti-Maus Ig

Ig - Immunoglobulin(an Antikörper isotype)

NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - phenylmethylsulfonyl Fluorid

BSA - Tier-Serum-Albumin

NFDM - fettfreie trockene Milch

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