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Westliche Fehlersuchflecken

  Die molekulare Station-Anleitung zu den westlichen befleckenden Problemen und zu den Lösungen: Geläufige westliche Fleck-Probleme und Lösungen für sie!

Treten Sie mit uns bitte mit Ihren Ideen in Verbindung, wenn Sie dieser Anleitung hinzufügen können.

 

Was ist Ihr westliches Fleckproblem? - Alphabetisch Organisiert

Flockige Bänder

Niedriges Signal

Membrane glüht in den dunklen Raum

Hoher Hintergrund

Punkte auf Film

Zu viele Bänder im westlichen Fleck

Schwaches Signal

 

 

Westliches Fleck-Fehlersuchproblem:

Punkte auf Film (fehlende Bänder) :

- Arme-Übertragung wegen der Luftblasen während der Übertragung auf Membrane

- schmutziger Film beim Hinzufügen dem Entwickler

- Entwicklerrollen sind schmutzig

Lösung zu den Punkten auf Film:

- benutzen Sie eine pasteur Pipette als Rolle Rolle die Membrane und das Gel vor Übertragung, um die Luftblasen Unterhaltmembrane und -materialien zu löschen, die naß sind.

- halten Sie Film sauber, bevor Sie dem Entwickler hinzufügen

 

Westliches Fleck-Fehlersuchproblem:

Zu viele Bänder im westlichen Fleck:

- normalerweise wegen vieler unspezifischer Bänder

- schlechte Primärantikörperqualität oder alter Antikörper

- nicht genug blockend

- proteolytische Spaltung des Antigens - alle zusätzlichen Bänder sind niedrigerer MW als Ihr Protein, (IE Ihr Protein wird entdeckt, aber wurde vermindert)

Lösungen zu zu vielen Bändern auf westlichem Fleck:

- kaufen Sie einen anderen Antikörper oder ersetzen Sie mit einem frischen Antikörpervorrat

- Block mit 5% der trockenen fettfreien Milch oder BSA vor dem Hinzufügen hauptsächlich. Wenn Sie bereits blocken, erwägen Sie, während der Primär- und Sekundärantikörperausbrütungen zu blocken und auch sich zu erhöhen, Milch oder BSA Konzentration blockend.

- halten Sie alles auf Eis, benutzen Sie frische Proben, speichern Sie innen - 80C, und benutzen Sie Proteasehemmnisse wie PMSF

 

Westliches Fleck-Fehlersuchproblem:

Hoher Hintergrund; niedriges Geräuschabstand auf westlichem Fleck

- Schwarzes oder jeder dunkle Film; Film war herausgestelltes zu langes

- das Blocken war unzulänglich; unspezifische Schwergängigkeit des Primärantikörpers und Sekundärantikörper wurden nicht vollständig gewaschen

- Reinigung war unzulänglich

- Film glüht in Dunkelheit! - zu hohe Sekundär- oder Primärverdünnungen

Lösungen zum dunklen Film:

- Exposé während weniger Zeit, Abnahmeberührung Zeit

- erhöhen Sie das Blocken von von Dauer der fettfreien trockenen Ausbrütung der Milch 5% oder erhöhen Sie die Konzentration.

- auch Sie können mit, vollständigem Serum des Hauptrechnertieres mit (oder vorher) dem Sekundärantikörper zu blocken versuchen

- erhöhen Sie waschende Zeiten und Datenträger zur Hilfe löschen jedes unspezifische Signal wegen der schwachen Antikörperschwergängigkeit.

- das Verwenden eines stärkeren Reinigungsmittels, um - anstelle von TBST (Tween-20) zu waschen, stärkere Reinigungsmittel wie NP-40 oder SDS zu benutzen, die eine zwingendere Wäsche zur Verfügung stellen und Hintergrund verringern können (tun dies nur wenn Sie mit einem Band versehen, ist stark! - auch waschen löscht irgendein Ihr Band des Interesses!)

- sehr hohe SekundärKonzentration des antikörpers (oder sogar Primär) - führen Sie Optimierung Experimente durch, um korrekte Antikörperverdünnungen festzustellen verdünnen die Antikörper weiter.

 

Westliches Fleck-Fehlersuchproblem:

Niedriges Signal oder schwaches Signal

- wegen nicht genügenden Proteins lud auf dem Gel

- Primärantikörper ist alt oder nicht gut

- Phosphoproteine benötigen normalerweise Nachtprimärantikörperausbrütung

- nicht genügend Sekundärantikörper

- über-blockend

- sich entwickelnde Reagenzien sind falsch/Sie machten einen Fehler, wenn sie sie vorbereiten

Lösungen zum niedrigen Signal oder zum schwachen Signal:

- laden Sie mehr Proteinprobe auf Gel

- Versuchfrischer Primärantikörper

- brüten Sie Primärantikörper overnite für Phosphoproteine bei 4 Grad C aus (Kühlraumschüttel-Apparat)

- erhöhen Sie Konzentration des Proteins (lösen Sie Proben in weniger Lysisbuffer auf)

- verringern Sie Konzentration des Blockenmittels

- überprüfen Sie die sich entwickelnden Reagenzien; bereiten Sie frische Ausführungssteuersprache und re-ECL die Membrane vor

- erhöhen Sie die Konzentration oder die Länge der Primärantikörperausbrütungperiode

- erhöhen Sie Konzentration oder die Länge der Sekundärantikörperausbrütungperiode

 

Flockige Bänder, Bänder geschmiert, Bänder nicht scharf

- Bänder geschmiertes wegen des heißen Gels

- flockiges der Bänder wegen der Hochspannung

Lösungen zu den flockigen Bändern und zu den nicht scharfen Bändern:

- verringern Sie Spannung oder aktuell, laufen Sie in Kühlraum, und bereiten Sie neuen laufenden Buffer vor (Hitze veranläßt das Gel, seine Starrheit und sein Auflösungsvermögen zu verlieren)

- vor-tränken Sie Übergangsmembrane in der passenden Übergangslösung (festgestellt vom Membrane Hersteller) für die benötigte Zeitspanne.