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Westliches befleckendes Protokoll

Westlich-beflecken Sie Protokoll

Vorbereitung der Proben für SDS-PAGE Gel-Elektrophorese von vorbereiteter Zelle Lysates

Bereiten Sie Gele für SDS-PAGE vor
Bereiten Sie laufenden Buffer 1X vor
Fügen Sie 50 ml Beta-merkaptoäthanol 950 ml-Beispielbuffer hinzu (für 1 ml). (nur wenn Sie Beta-merkaptoäthanol nicht zum Beispielbuffer vor-hinzugefügt haben)
Fügen Sie Beispielbuffer jeder Probe hinzu (bestimmen Sie vor, wie viel Probe Sie pro Vertiefung laden können - BioRad dünn Kämme können über 30uL beibehalten. Große Kämme machen accomate bis zu 50uL) ein.
Turbulenzproben kurz.
Stoßen Sie ein Loch in der Schutzkappe jedes Gefäßes (die Oberseiten verhindern knallend, beim Kochen)
Blutgeschwür im Heizungsblock/-wasserbad an (95°C) für 5 Minuten (niedrigere Temperaturen sind gezeigt worden, um unspezifische Proteinanhäufung zu verhindern)

Nachdem Protein-Proben - Laden und Betrieb das SDS-PAGE Gel gekocht worden sind

Zentrifugieren Sie Proben für 1 Minute an der großen Geschwindigkeit.
Laden Sie Probe in jeden Weg.
Laden Sie Referenz MW-(Molekulargewichtstrichleiter). (Sie können wünschen
Lassen Sie Gel an 100V laufen (100V durch das Stapeln des Gels, Spannung kann bis zu 200V, beim Laufen erhöht werden in das Trennen des Gels mit viel des laufenden Buffers)

Übertragung der Protein-Proben auf Membrane

Bereiten Sie Buffer des Übergangs 1X vor
Tränken Sie und rütteln Sie Gel im Übergangsbuffer für Minute 15
Tränken Sie Nitrozellulosemembrane (oder PVDF) und das Filterpapier (besonders stark) für einige Minuten.
Platzieren Sie Sandwich auf Übergangszelle:

Starker Filterpapier EXTRAFREIER RAUM
Membrane
Gel
Starkes Filterpapier EXTRASCHWARZES

Elektrische Übertragung: overnite 35V oder 90V 1 Stunde lang abhängig von der Größe Ihres Proteins oder Ihrer Geduld!

Westliches befleckendes Protokoll oder Immunoblotting

Bereiten Sie 1X TBST von den auf lagerlösungen vor.
Bereiten Sie das Blocken des Buffers vor (3% das Rinderserum-Albumin oder der 5% Beflecken-Grad die Milch (Blotto) in TBST). (Sie können einige verschiedene blockenmale und Bedingungen versuchen wünschen).
Waschen Sie Membrane in 1X TBST mit dem Rütteln für 10 Min.
Blocken Sie bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang mit dem Blocken des Buffers (Rütteln oder Kreisrotator)
Brüten Sie Ihre Membrane (PVDF oder Nitrozellulose) mit Primär1° AB Antikörper über Nacht (für das schwierige Beflecken bedingt IE-Phosphorylierung der Proteine) oder 1 Stunde für (einfache Bedingungen wie Gesamtprotein) an 4°C (overnite) oder an der Raumtemperatur (nur 1-Stunden-Ausbrütung) umfaßt mit Saranverpackung aus (leichtes Rütteln). Sie können Plastikwannen vom Dollarspeicher für dieses benutzen (verwenden Sie diese nur für das Beflecken!) oder Gebrauchpipette-Kastenunterseiten. Die Verdünnung für Primärantikörper ist um 1:1000. Sehen Sie Anweisungen des Herstellers.
Waschen Sie sich mit 1X TBST 3 x Minute 15
Brüten Sie Ihre Membrane (PVDF oder Nitrozellulose) mit Sekundärantikörper, 2° AB für 30 - 45 minimal oder (1 Stunde - für schwierige befleckende Bedingungen) aus, bei Zimmertemperatur. Die Verdünnung für Sekundärantikörper ist normalerweise 1:10,000 oder höher. (IE 1uL von Sekundär in 10mL von TBST pro Membrane) sehen Sie Anweisungen des Herstellers. Sie können Ihren Antikörper dem Blocken der Lösung hinzufügen wünschen, um unspezifische Schwergängigkeit zu verringern, besonders wenn Sie hohen Hintergrund in Ihrem ersten Experiment erhielten.
Wäsche mit TBST 4-5 x 10 Min. Dieses ist der wichtigste waschende Jobstepp.
Ausführungssteuersprache (5min)
Exposee zum Film. Normalerweise ist Expositionsdauer der westlichen Flecken ungefähr 10-30 Sekunden. Länger (5-10 Minuten) für Phosphorylierung. Wenn Sie ein wirklich schwaches Signal, entweder haben, Sie müssen mehr Protein laden oder Versuch, um Expositionsdauer (bis 30 Minuten - Sie können ihn in, einer Kassette länger zu lassen versuchen) zu erhöhen.
Halten Sie Ihre Membrane! Sie können Ihre Membrane in TBST 1X im Kühlraum für eine Weile halten. Sie können ihn aus den folgenden Gründen benötigen: 1) Prüfung des Ladens (Papierrezensenten können um Gesamtprotein oder einen Ladenstandard wie Actin bitten). Auch Sie können für ein Phosphoprotein und dann entfernen und reprobe für Gesamtprotein zuerst prüfen.