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Westliches Befleckendes Protokoll

Westlich-beflecken Sie Protokoll

Vorbereitung der Proben für SDS-PAGE Gel-Elektrophorese von vorbereiteter Zelle Lysates

1. Bereiten Sie Gele für SDS-PAGE vor
2. Bereiten Sie 1X laufenden Buffer vor
3. Fügen Sie 50 ml Beta-Merkaptoäthanol 950 ml Beispielbuffer hinzu (für 1 ml). (nur wenn Sie Beta-Merkaptoäthanol nicht zum Beispielbuffer vor-hinzugefügt haben)
4. Fügen Sie Beispielbuffer jeder Probe hinzu (bestimmen Sie vor, wieviel Probe Sie pro Vertiefung laden können - BioRad dünn Kämme können über 30uL beibehalten. Große Kämme machen accomate bis zu 50uL) ein.
5. Turbulenzproben kurz.
6. Stoßen Sie eine Bohrung in der Schutzkappe jedes Gefäßes (die Oberseiten verhindern knallend beim Kochen)
7. Blutgeschwür Heizung block/water im Bad an (95°C) für 5 Minuten (niedrigere Temperaturen sind gezeigt worden, um unspezifische Proteinanhäufung zu verhindern)

Nachdem Protein-Proben - Laden und Betrieb das SDS-PAGE Gel gekocht worden sind

1. Zentrifugieren Sie Proben für 1 Minute an der großen Geschwindigkeit.
2. Laden Sie Probe in jeden Weg.
3. Laden Sie MW (Molekulargewichtstrichleiter) Referenz (Sie können wünschen
4. Lassen Sie Gel an 100V laufen (100V durch das Stapeln des Gels, Spannung kann bis zu 200V beim Laufen erhöht werden in das Trennen des Gels mit viel des laufenden Buffers)

Übertragung der Protein-Proben auf Membrane

1. Bereiten Sie 1X Übergangsbuffer vor
2. Tränken Sie und rütteln Sie Gel im Übergangsbuffer für 15 Minuten
3. Tränken Sie Nitrozellulosemembrane (oder PVDF) und das Filterpapier (besonders stark) für einige Minuten.
4. Plazieren Sie Sandwich auf Übergangszelle:

Starker Filterpapier EXTRAFREIER RAUM
Membrane
Gel
Starkes Filterpapier EXTRASCHWARZES

5. Elektrische Übertragung: overnite 35V oder 90V 1 Stunde lang abhängig von der Größe Ihres Proteins oder Ihrer Geduld!

Westliches befleckendes Protokoll oder Immunoblotting

1. Bereiten Sie 1X TBST von den auf lagerlösungen vor.
2. Bereiten Sie das Blocken des Buffers vor (das 3% Tier-Serum-Albumin oder der 5% Beflecken-Grad Milch (Blotto) in TBST). (Sie können einige unterschiedliche blockenmale und Bedingungen versuchen wünschen).
3. Waschen Sie Membrane im 1X TBST mit dem Rütteln für 10 Minuten.
4. Block bei der Raumtemperatur 1 Stunde lang mit dem Blocken des Buffers (Rütteln oder kreisförmiger Rotator)
5. Brüten Sie Ihre Membrane (PVDF oder Nitrozellulose) mit Primär1° AB Antikörper über Nacht (für das schwierige Beflecken bedingt IE Phosphorylierung der Proteine) oder 1 Stunde für (einfache Bedingungen wie Gesamtprotein) an 4°C (overnite) oder an der Raumtemperatur (nur 1 Stunde Ausbrütung) umfaßt mit Saranverpackung aus (leichtes Rütteln). Sie können Plastikwannen vom Dollarspeicher für dieses benutzen (verwenden Sie diese nur für das Beflecken!) oder Gebrauchpipette-Kastenunterseiten. Die Verdünnung für Primärantikörper ist herum 1:1000. Sehen Sie Anweisungen des Herstellers.
6. Waschen Sie mit 1X TBST  3 x 15 Minuten
7. Brüten Sie Ihre Membrane (PVDF oder Nitrozellulose) mit Sekundärantikörper, 2° AB für 30 – 45 Minuten oder (1 Stunde - für schwierige befleckende Bedingungen) bei der Raumtemperatur aus. Die Verdünnung für Sekundärantikörper ist normalerweise 1:10,000 oder höheres. (IE 1uL von Sekundär in 10mL von TBST pro Membrane) sehen Sie Anweisungen des Herstellers.  Sie können Ihren Antikörper dem Blocken der Lösung hinzufügen wünschen, um unspezifische Schwergängigkeit zu verringern, besonders wenn Sie hohen Hintergrund in Ihrem ersten Experiment erhielten.
8. Wäsche mit TBST   4-5 x 10 Minute. Dieses ist der wichtigste waschende Jobstep.
9. Ausführungssteuersprache (5min)
10. Exposé zum Film. Normalerweise ist Berührung Zeit der westlichen Flecken ungefähr 10-30 Sekunden. Länger (5-10 Minuten) für Phosphorylierung. Wenn Sie ein wirklich schwaches Signal, entweder haben, Sie müssen mehr Protein laden oder Versuch, um Berührung Zeit (bis 30 Minuten - Sie können ihn in, einem casette länger zu lassen versuchen) zu erhöhen.
11. Halten Sie Ihre Membrane! Sie können Ihre Membrane im TBST 1X im Kühlraum für eine Weile halten. Sie können ihn aus den folgenden Gründen benötigen: 1) Überprüfung des Ladens (Papierrezensenten können um Gesamtprotein oder einen Ladenstandard wie Actin bitten). Auch Sie können für ein Phosphoprotein und dann entfernen und reprobe für Gesamtprotein zuerst prüfen.

Sehen Sie auch unser westliches befleckendes Membrane entfernendes Protokoll