Protein-Konzentration

Protein-Ermittlung durch UVabsorption

Nahe UVabsorption

Nahe UVabsorption ist UVabsorption bei 280 Nanometer: Ein einfaches Spektrometer kann die Menge des Proteins in einer Lösung mengenmäßig bestimmen. Strahlungsabsorption durch Proteine im nahen UV abhängt vom Inhalt von Tyr und von Tr r (und in einem Umfang auf der Menge von Phe und von Disulfidbindungen). So schwankt das A280 groß zwischen verschiedene Proteine (für ein 1 mg/ml Lösung, von 0 bis 4 [für etwas Tyrosin-reiche Wolleproteine], obgleich die meisten Werte in der Strecke 0.5-1.5 sind). Diese Methode hat seine Vorteile; sie ist einfach und die Probe ist wiederherstellbar. Seien Sie das, wie es es hat auch Nachteile, die umfassen, Störung von anderen Chromophoren kann, und der spezifische Absorptionswert für ein gegebenes Protein entschlossen sein muss. Die Löschung der Nukleinsäure in der 280 Nanometer Region kann 10mal soviel wie sein, denen vom Protein an ihrer gleichen Wellenlänge und folglich, einige Prozente Nukleinsäure die Absorption groß beeinflussen können.

Weite UVabsorption

Absorption der Peptidbindung ist stark im weit UV mit einem Maximum an ungefähr 190 Nanometer Die starke Absorption der Proteine an diesen Wellenlängen verwendet worden in der Proteinermittlung. Wegen der Schwierigkeiten, die durch Absorption durch Sauerstoff und die niedrige Ausgabe der herkömmlichen Spektrofotometer an dieser Wellenlänge verursacht, gebildet Messen bequemer bei 205 Nanometer, in denen die Absorption über Hälfte die bei 190 Nanometer ist. Die meisten Proteine haben Löschungkoeffizienten bei 205 Nanometer für ein 1 mg/ml Lösung von 30-35 und zwischen 20 und 24 bei 210 Nanometer. Verschiedene Seitenketten, einschließlich die von Trp, Phe, Tyr, seins, Cys, getroffen und Arg (in dieser absteigenden Folge), bilden Beiträge zum A205. Die Vorteile dieser Methode umfassen Einfachheit und Empfindlichkeit. Die Probe ist wiederherstellbar und zusätzlich gibt es wenig Veränderung der Antwort zwischen verschiedenen Proteinen und so ermöglicht nah-absolute Ermittlung des Proteins. Nachteile dieser Methode umfassen die Notwendigkeit für genaue Kalibrierung des Spektrofotometers im weit UV. Viele Buffer und andere Bestandteile, wie Heme- oder Pyridoxalgruppen, aufsaugen stark in dieser Region er.

Sehen Sie auch unsere Protein-Konzentrations-Protokoll-und Protein-Konzentrations-Protokolle von anderen Labors.