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Protein-Ermittlung durch UVABSORPTION Protokoll

Protein-Ermittlung durch das UVABSORPTION Protokoll, (geändert vom Protokoll durch Alastair Aitken und Michèle P. Learmonth)

Materialien für UVPROTEIN-Konzentration

1. 0.1 M K2SO4 (pH 7.0).
2. 5 Millimeter Kaliumphosphatbuffer, pH 7.0.
3. Nichtionogenes Reinigungsmittel (0.01% Brij 35)
4. Guanidinium-HCl.
5. Filter der 0.2-µm Nesselkoralle (Watford, Großbritannien).
6. UV-SICHTBARES Spektrometer: Die Wasserstofflampe sollte für maximale Intensität     ausgewählt werden
an der bestimmten Wellenlänge.
7. Cuvets, Quarz, für < 215 nm.

Protein-Konzentration UVMETHODE

 Schätzung des Proteins durch Near UV Absorption (280 nm):

1. Ein zuverlässiges Spektrofotometer ist notwendig. Die Proteinlösung muß in verdünnt werden
Buffer zu einer Konzentration, die mittendrin die genaue Strecke des Instrumentes ist (sehen Anmerkungen 1 und 2).

2. Die gemessen zu werden Proteinlösung kann in einer breiten Strecke der Buffer sein, also ist es normalerweise kein Problem, zum ein zu finden, das für das Protein angebracht ist, das in einem bestimmten Buffer bereits sein kann, der für einen Reinigungjobstep oder -probe für Enzymaktivität benötigt wird, z.B. (sehen Sie Anmerkungen 3 und 4).

3. Messen Sie die Absorption der Proteinlösung bei 280 nm mit den Quarz cuvets oder cuvets, die bekannt, um zu dieser Wellenlänge transparent zu sein, gefüllt mit einem Datenträger der Lösung genügend, die Blendenöffnung zu bedecken, durch die der Lichtstrahl überschreitet.

4. Der erhaltene Wert hängt von der Pfadlänge des cuvet ab. Wenn nicht 1 Zentimeter, es sein muß
justiert durch den passenden Faktor. Das Bier-Lambert Gesetz gibt das an: A (Absorption) = ε c L, in dem ε = Löschungkoeffizient, c = Konzentration in mol/L und L = optische Pfadlänge in Zentimeter folglich, wenn ε bekannt, Messen von A die Konzentration direkt gibt, ε ist
normalerweise veranschlagen für eine Länge des Pfades 1-Zentimeter.

5. Der tatsächliche Wert der UVABSORPTION für ein gegebenes Protein muß durch irgendeine absolute Methode festgestellt werden z.B. errechnet worden von der Aminosäurestruktur, die durch Aminosäureanalyse festgestellt werden kann. Die UVABSORPTION für ein Protein wird dann entsprechend der folgenden Formel errechnet: A280 (1 mg/mL) = (5690nw + 1280ny + 120nc)/M
von wo Nanowatt, ny und nc die Zahlen Trp, Tyr und Cys Überresten im Polypeptid sind
Masse M und 5690, 1280 und 120 sind die jeweiligen Löschungkoeffizienten für diese Überreste (sehen Sie Anmerkung 5).

Sehen Sie auch Protein-Konzentration Protokolle von anderen Labors.

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