Protein-Ermittlung durch UVabsorptions-Protokoll

Protein-Ermittlung durch das UVabsorptions-Protokoll, (geändert vom Protokoll durch Alastair Aitken und Michèle P. Learmonth)

Materialien für UVprotein-Konzentration

1. 0.1 M K2SO4 (pH 7.0).
2. 5 Millimeter-Kaliumphosphatbuffer, pH 7.0.
3. Nichtionogenes Reinigungsmittel (0.01% Brij 35)
4. Guanidinium-HCl.
5. Filter der 0.2-µm Nesselkoralle (Watford, Großbritannien).
6. UV-sichtbares Spektrometer: Die Wasserstofflampe sollte für Maximum ausgewählt werden Intensität
an der bestimmten Wellenlänge.
7. Cuvets, Quarz, für <215 Nanometer.

Protein-Konzentrations-UVmethode

Schätzung des Proteins durch nahe UVabsorption (280 Nanometer):

1. Ein zuverlässiges Spektrofotometer ist notwendig. Die Proteinlösung muss in verdünnt werden
Buffer zu einer Konzentration, die mittendrin die genaue Strecke des Instrumentes ist (sehen Anmerkungen 1 und 2).

2. Die gemessen zu werden Proteinlösung kann in einer großen Auswahl der Buffer sein, also ist es normalerweise kein Problem, zum ein zu finden, das für das Protein angebracht ist, das in einem bestimmten Buffer bereits sein kann, der für einen Reinigungjobstep oder -probe für Enzymaktivität benötigt wird, z.B. (sehen Sie Anmerkungen 3 und 4).

3. Messen Sie die Absorption der Proteinlösung bei 280 Nanometer, unter Verwendung der Quarz cuvets oder cuvets, die bekannt, um zu dieser Wellenlänge transparent zu sein, gefüllt mit einem Datenträger der Lösung genügend, die Blendenöffnung zu bedecken, durch die der Lichtstrahl überschreitet.

4. Der erhaltene Wert hängt von der Pfadlänge des cuvet ab. Wenn nicht 1 cm, es sein muss
justiert durch den passenden Faktor. Das Bier-Lambert-Gesetz gibt das an: A (Absorption) = ε c L wo ε = Löschungkoeffizient, c = Konzentration in mol/L und L = Länge des optischen Pfades in cm. Folglich wenn ε bekannt, gibt Messen von A die Konzentration direkt, ε ist
normalerweise veranschlagen für eine 1 cm-Pfadlänge.

5. Der tatsächliche Wert der UVabsorption für ein gegebenes Protein muss durch irgendeine absolute Methode festgestellt werden z.B. berechnet worden von der Aminosäurestruktur, die durch Aminosäureanalyse festgestellt werden kann. Die UVabsorption für ein Protein wird dann entsprechend der folgenden Formel berechnet: A280 (1 mg/ml) = (5690nw + 1280ny + 120nc) /M
von wo Nanowatt, ny und nc die Zahlen Trp, Tyr und Cys Rückständen im Polypeptid sind
Masse M und 5690, 1280 und 120 sind die jeweiligen Löschungkoeffizienten für diese Rückstände (sehen Sie Anmerkung 5).

Sehen Sie auch Protein-Konzentrations-Protokolle von anderen Labors.