Immunopräzipitation

Proben können nach Niederschlag und Zentrifugierung dann gewaschen werden. Die Niederschläg können auf SDS-PAGE Gele mit Proteinbeispielbuffer dann laufen gelassen werden. Normalerweise sind die Proteinproben vor Zellenzerstörung radioaktiv. Dieses wird getan, indem man normalerweise radioaktive Aminosäuren Zellen hinzufügt. Dieses bildet Sachen einfach, während das Protein dann leicht auf Film, wenn es auf ein Gel als der Punkt gelaufen wird, ausstrahlt Radioaktivitäts- und Exposeefilm entdeckt wird. Sie können für die Größe des Proteins (im Molekulargewicht mit dem Vergleich, zum von Standards zu sortieren) und Quantität dann festsetzen (durch das Vergleichen der behandelten Proben oder mit einem Standard von Quantitäten).

Außerdem erlaubt die Immunopräzipitationprozedur auch die Konzentration der Proteine, die nicht sehr reichlich vorhanden oder schwierig, unter Verwendung des westlichen Flecks zu entdecken sind. IP kann Proteine bis zu Falte 10.000 konzentrieren, während es große Datenträger Zelle lysates nehmen und Ihr Protein des Interesses in einen kleinen Niederschlag konzentrieren kann, der für westliche Fleckanalyse oder andere Methoden dann benutzt werden kann.

Anwendungen der Immunopräzipitation:

1) Ermittlung des Molekulargewichtes und der Quantität des immunoprecipitated Proteins durch SDS-PAGE.

2) wird Immunopräzipitation verwendet, um für Proteinprotein Interaktionen festzusetzen. Dieses wird getan, indem man für ein Protein Immunopräzipitation, und dann für ein anderes Protein beflecken.

3) Quantifikation von Kinetik der Synthese eines Proteins in den Zellen durch die Bestimmung des radioaktiven Proteins der Quantität gebildet während einer spezifischen Zeitmenge.

4) aktiviert Immunopräzipitation zur Konzentration der Proteine, die anders schwierig zu entdecken sind.

Die Immunopräzipitationmethode kann in einige Jobstepps unterteilt werden:

Abhängig von der Anwendung der Immunopräzipitation oder des IP, wünschen Sie verschiedene Zerstörungbuffer benutzen.  Die Wahl des Zerstörungbuffers ist wichtig und ist von den Eigenschaften des Proteins des Interesses abhängig.

Wenn Phosphorylierung der Proteine oder der Proteinprotein Interaktionen studieren möchten, sollten Sie Np-40 versuchen.

Wenn Sie Gesamtproteinniveaus eines Proteins studieren, sollten Sie RIPA versuchen.

• 50 Millimeter Tris-HCl
• Justieren Sie auf pH 7.4
• 150 Millimeter NaCl
• 1 Millimeter PMSF
• 1 Millimeter-EDTA
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1% Triton x-100
• 1% Natriumdesoxycholat
• 0.1% SDS

• 50 Millimeter Tris-HCl-Schluss-Konzentration
• 150 Millimeter NaCl-Schluss-Konzentration
• Fügen Sie 1% NP-40 hinzu
• Justieren Sie auf pH 8.0

Der preclear Jobstepp ist normalerweise für Immunopräzipitation erfolgt, weil er die Menge der unspezifischen Proteine im Zelle lysate senkt. Außerdem löscht Vorreinigung auch Proteine, die mögliche unspezifische Interaktionen und eine hohe Affinität für Protein A, Protein G, Immunoprecipitin, Zysorbin haben können, oder was unlöslichem Formular des verbindlichen Proteins des Antikörpers Sie zu pull-down Ihren Antikörper benutzen. Einige Forscher finden diesen Jobstepp nicht notwendig und überspringen diesen Jobstepp. Versuch Vorreinigung, das erste mal Sie Immunopräzipitation versuchen. Wenn Ihre Resultate ziemlich klar sind, versuchen Sie, Vorreinigung folgendes Experiment zu überspringen und sehen Sie, wie es ausfällt.

Welchen Antikörper sollten Sie für Immunopräzipitation benutzen? Normalerweise Polyclonal Antikörper werden für immunoprecipation benutzt.

Die Antikörperantigen Komplexe sind nicht selbst, IE unlöslich. Immunopräzipitation, ist nicht eine komplette Idee. Antikörper und ihre Schwergängigkeit zu den Antigenen sind im Blut, Buffer und während des Immunopräzipitationexperimentes löslich.  Was verwendet wird, um diese Komplexe heraus auszufällen, ist verbindliche Proteine des unlöslichen Antikörpers. Proteine A und G, wurden vom Bakterium und von der Bindung zur konstanten Region des Antikörpers lokalisiert.

Beispiele der verbindlichen Proteine des unlöslichen Antikörpers, die benutzt werden, um Komplexe in der Immunopräzipitation auszufällen, sind:

• Protein A
• Protein G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

  Das Waschen der Komplexe wird unter Verwendung RIPA, PBS getan, Buffer oder andere Buffer IP-wäscht abhängig von, was Sie nach IP analysieren möchten. RIPA Buffer ist zwingender, während PBS weniger zwingend ist.

IP-Wäsche-Buffer-Rezept

• 10mM Tris; Justieren Sie auf pH 7.4
• 1mM EDTA
• 1mM EGTA; pH 8.0
• 150mM NaCl
• 1% Triton X-100
• 0.2mM Natriumc$orthovanadate
• Proteasehemmniscocktail

Schlussbemerkungen für Immunopräzipitation

  Immunopräzipitationerfolg ist von der Affinität des Antikörpers für sein Antigen abhängig.  Ein guter Immunopräzipitationantikörper gibt Ihnen niedrigen Hintergrund, wenn Sie die Proben unter Verwendung anderer Techniken nach IP analysieren.  Die unlöslichen Antikörper-bindenen Proteine, die benutzt werden, sind auch sehr wichtig. Polyclonal Antikörper sind die besten Antikörper, zum der jedoch gereinigten monoclonal Antikörper zu benutzen können auch verwendet werden.  Überprüfen Sie Ihren Antikörperverkäufer, um zu sehen, wenn Ihr monoclonal Antikörper auf Immunopräzipitation geprüft wurde.

Spitzen für Immunopräzipitation

• Benutzen Sie die 2 ml-Gefäße für Immunopräzipitation, wie sie Niederschläg leicht gewaschen und erneut ausgesetzt werden
• Versuchen Sie, den Vorreinigung Jobstepp zu überspringen, um Zeit zu sparen
• Anstatt, mit sich zu waschen, IP-waschen Sie Bufferversuch PBS
• Wenn Sie bereits niedrigen Hintergrund haben und Ihr Antikörper groß ist, versuchen Sie IP, das 2X anstelle von 5X wäscht
• Stellen Sie Sie sicher, so viel Flüssigkeit von den eppendorf Gefäßen zu löschen wenn Immunopräzipitationreinigung