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Immunopräzipitation

Immunopräzipitation ist eine Technik, die die Antikörper benutzt, die zu einem Protein, um jene Proteine von der Lösung zu löschen spezifisch sind. Die Antikörper-Protein Komplexe werden aus Lösung mit der Hinzufügung eines unlöslichen Formulars der verbindlichen Proteine des Antikörpers heraus ausgefällt. Beispiele schließen Protein A, Protein G, Zysorbin, Immunoprecipitin oder die Hinzufügung eines zweiten Antikörpers zur Lösung ein (sehen Sie Diagramm 1 unten).

Immunopräzipitation-Inhaltsverzeichnis

1. Immunopräzipitation-Hintergrund
2. Immunopräzipitation-Buffer
3. Neue Immunopräzipitation-Themen
4. Immunopräzipitation-Protokolle
5. Immunopräzipitation-Rundschreiben
6. Immunopräzipitation-Artikel
7. Immunopräzipitation-Fehlersuche

Diagramm 1.

Proben können nach Niederschlag und Zentrifugierung dann gewaschen werden. Die Niederschläg können auf SDS-PAGE Gele mit Proteinbeispielbuffer dann laufen gelassen werden. Normalerweise sind die Proteinproben vor Zelle Lysis radioaktiv. Dieses wird getan, indem man normalerweise radioaktive Aminosäuren Zellen hinzufügt. Dieses bildet Sachen einfach, während das Protein dann leicht auf Film, wenn es auf ein Gel als der Punkt gelaufen wird, ausstrahlt Radioaktivität und Exposéfilm entdeckt wird. Sie können für die Größe des Proteins (im Molekulargewicht mit dem Vergleich, zum von von Standards zu sortieren) und Quantität dann festsetzen (durch das Vergleichen der behandelten Proben oder mit einem Standard von Quantitäten).

Außerdem erlaubt die Immunopräzipitationprozedur auch die Konzentration der Proteine, die nicht sehr reichlich vorhanden oder schwierig mit westlichem Fleck zu entdecken sind. IP kann Proteine bis zu 10,000-fold konzentrieren, während es große Datenträger Zelle lysates nehmen und Ihr Protein des Interesses in einen kleinen Niederschlag konzentrieren kann, der für westliche Fleckanalyse oder andere Methoden dann benutzt werden kann.

 

Anwendungen der Immunopräzipitation:

1) immunoprecipitated Ermittlung des Molekulargewichtes und der Quantität von Protein durch SDS-PAGE.

2) wird Immunopräzipitation verwendet, um für Protein-Protein Interaktionen festzusetzen. Dieses wird getan, indem man für ein Protein Immunopräzipitation, und dann für ein anderes Protein beflecken.

3) Quantifikation von Kinetik der Synthese eines Proteins in den Zellen durch die Bestimmung des Quantität radioaktiven Proteins gebildet während einer spezifischen Zeitmenge.

4) aktiviert Immunopräzipitation zur Konzentration der Proteine, die anders schwierig zu entdecken sind.

 

Die Immunopräzipitationmethode kann in einige Jobsteps geteilt werden:

1. Beispielvorbereitung und Zelle Lysis
2. Preclearing der Lösung
3. Ausbrütung mit Antikörper und Anordnung der Antikörper-Antigen Komplexe
4. Niederschlag des Komplexes des Interesses
5. Reinigung der Antikörper-Antigen Komplexe, zum der unspezifischen Proteine und der Verschmutzer zu löschen.
6. Analyse von complexes/antigen des Interesses durch SDS-PAGE

Immunopräzipitation-Protokolle	Immunopräzipitation-Protokoll-Verzeichnis (externe Links)	Suchen Sie Immunopräzipitation Fehler	Erlernen Sie über Immunopräzipitation

Immunopräzipitation-Beispielvorbereitung und Zelle Lysis

 

Immunopräzipitationlysis-Buffer

Abhängig von der Anwendung der Immunopräzipitation oder des IP, wünschen Sie unterschiedliche Lysisbuffer benutzen.  Die Wahl des Lysisbuffers ist wichtig und ist von den Eigenschaften des Proteins des Interesses abhängig.

Wenn Phosphorylierung der Proteine oder der Protein-Protein Interaktionen studieren möchten, sollten Sie Np-40 versuchen.

Wenn Sie Gesamtproteinstufen eines Proteins studieren, sollten Sie RIPA versuchen.

RIPA Buffer gibt untereren Hintergrund in der Immunopräzipitation. Jedoch kann RIPA etwas Proteine denaturieren. Wenn Sie leiten, experimentiert Immunopräzipitation, um Protein-Protein Interaktionen, RIPA zu studieren sollte nicht verwendet werden, während sie protein:protein Interaktionen stören kann.

Buffer NP-40 hat eine unterere deanturing Stufe und wird folglich für Phosphorylierungexperimente wie Betrachten von von Kinaseaktivität verwendet. Auch NP-40 wird für Protein-Protein Interaktionen verwendet. NP40 ist ein nichtionogenes Reinigungsmittel und ist das am geläufigsten benutzte Reinigungsmittel in den Zelle Lysisbuffer für Immunopräzipitation und westlichen Fleck.

RIPA Zelle Lysis-Buffer - Immunopräzipitation-Buffer-Rezept

• 50 Millimeter Tris-HCl
• Justieren Sie auf pH 7.4
• 150 Millimeter NaCl
• 1 Millimeter PMSF
• 1 Millimeter EDTA
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1% Triton x-100
• 1% Natriumdesoxycholat
• 0.1% Sds

Zelle NP-40 Lysis-Buffer - Immunopräzipitation-Buffer-Rezept

• 50 Millimeter Tris-HCl Endrunde Konzentration
• 150 Millimeter NaCl Endrunde Konzentration
• Fügen Sie 1% NP-40 hinzu
• Justieren Sie auf pH 8.0

Vor-Reinigung für Immunopräzipitation

Der preclear Jobstep ist normalerweise für Immunopräzipitation erfolgt, weil er die Menge der unspezifischen Proteine im Zelle lysate senkt. Ausserdem löscht Vorreinigung auch Proteine, die mögliche unspezifische Interaktionen und eine hohe Affinität für Protein A, Protein G, Immunoprecipitin, Zysorbin haben können, oder was unlöslichem Formular des verbindlichen Proteins des Antikörpers Sie zu pull-down Ihren Antikörper benutzen. Einige Forscher finden diesen Jobstep nicht notwendig und überspringen diesen Jobstep. Versuch Vorreinigung, das erste mal Sie Immunopräzipitation versuchen. Wenn Ihre Resultate ziemlich klar sind, versuchen Sie, Vorreinigung folgendes Experiment zu überspringen und sehen Sie, wie es ausfällt.

 

IP: Ausbrütung-Antikörper und Anordnung der Antikörper-Antigen Komplexe

Welchen Antikörper sollten Sie für Immunopräzipitation benutzen? Normalerweise werden Polyclonal Antikörper für immunoprecipation benutzt.

 

Immunopräzipitation - Niederschlag des Komplexes des Interesses

Die Antikörper-Antigen Komplexe sind nicht durch selbst, IE Immunopräzipitation, ist nicht eine komplette Idee unlöslich. Antikörper und ihre Schwergängigkeit zu den Antigenen sind im Blut, Buffer und während des Immunopräzipitationexperimentes löslich.  Was verwendet wird, um aus diesen Komplexen auszufällen, ist verbindliche Proteine des unlöslichen Antikörpers. Proteine A und G, wurden vom Bakterium und von der Bindung zur konstanten Region des Antikörpers lokalisiert.

Beispiele der verbindlichen Proteine des unlöslichen Antikörpers, die benutzt werden, um Komplexe in der Immunopräzipitation auszufällen, sind:

• Protein A
• Protein G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

Immunopräzipitation - Waschende Jobsteps

  Das Waschen der Komplexe wird mit RIPA, PBS getan, Buffer oder andere Buffer IP-WÄSCHT abhängig von, was Sie nach IP analysieren möchten. RIPA Buffer ist zwingender, während PBS weniger zwingend ist.

IP Wäsche-Buffer-Rezept

• 10mM Tris; Justieren Sie auf pH 7.4
• 1mM EDTA
• 1mM EGTA; pH 8.0
• 150mM NaCl
• 1% Triton X-100
• 0.2mM Natrium ortho-vanadate-vanadate
• Proteasehemmniscocktail

 

Schlußbemerkungen für Immunopräzipitation

  Immunopräzipitationerfolg ist von der Affinität des Antikörpers für sein Antigen abhängig.  Ein guter Immunopräzipitationantikörper gibt Ihnen niedrigen Hintergrund, wenn Sie die Proben mit anderen Techniken nach IP analysieren.  Die unlöslichen Antikörper-bindenen Proteine, die benutzt werden, sind auch sehr wichtig. Polyclonal Antikörper sind die besten Antikörper, zum der jedoch gereinigten monoclonal Antikörper zu benutzen können auch verwendet werden.  Überprüfen Sie Ihren Antikörperverkäufer, um zu sehen, wenn Ihr monoclonal Antikörper auf Immunopräzipitation geprüft wurde.

 

Spitzen für Immunopräzipitation

• Benutzen Sie die 2 ml Gefäße für Immunopräzipitation, wie sie werden leicht gewaschen und erneut ausgesetzt ausfällen
• Versuchen Sie, den Vorreinigung Jobstep zu überspringen, um Zeit zu sichern
• Anstatt, mit zu waschen, IP-WASCHEN Sie Bufferversuch PBS
• Wenn Sie bereits niedrigen Hintergrund haben und Ihr Antikörper groß ist, versuchen Sie IP, das 2X anstelle von 5X wäscht
• Stellen Sie, so viel Flüssigkeit von den eppendorf Gefäßen zu löschen wenn Immunopräzipitationreinigung sicher

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