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Immunopräzipitation-Protokoll

Immunopräzipitation und Protokolle.

Grundlegendes Immunopräzipitation-Protokoll IP:

1. Behandeln Sie Ihre Zellen

2. Ernten Sie Zellen, indem Sie 500 ul des Solubilisierens des Buffers hinzufügen, reiben Sie und überschreiten Sie durch Spritze ein 21-gauge Zeiten der Nadel X5 zu homogenisieren.

3. Leiten Sie einen TCA-Niederschlag (dieses wird verwendet, um zu normalisieren wenn Sie radioaktiv die Zellen z.B. mit S-35)

4. Vor-Reinigung: Vor-frei, indem Sie 2 ul von X , Maus oder Kaninchen oder Ziege- Serum (woX die Tiersorte ist, in der der Primärantikörper angehoben wurde),vollständigen Proben hinzufügen und brüten Sie in einem Rotator für 30 Minuten bei der Raumtemperatur aus.

5. Löschen Sie X Serum, indem Sie mit dem 30 ul immunoprecipitin mit einer 30-Minute-Umdrehung bei der Raumtemperatur ausbrüten.

6. Zentrifugieren Sie Proben für 3 Minuten bei 13, 000 U/min.

7. Nach Zentrifugierung fügen Sie 5 ul des Primärantikörpers (X anti-Y spezifisches Protein, in dem Y der Antikörper ist, der in ein Tier für Ihr Protein des Interesses angehoben wird), den supernatants hinzu und brüten Sie über Nacht bei 4 Grad C aus.

8. Fügen Sie 100 ul von immunoprecipitin Proben hinzu. Wechselweise können Sie Zysorbin (Invitrogen) verwenden. (Zysorbin benötigt etwas geringfügige Änderungen am Protokoll)

9. Zentrifuge bei 13, 000 U/min für 3 Minuten. Löschen Sie den Supernatant.

10. Waschen Sie Tablette 3 X mit 1 ml des kalten IP Wäschebuffers (fügen Sie Proteasehemmnisse wah Buffer vor Gebrauch) hinzu, mit dem Rütteln für 5-10 Minuten zwischen jeder Wäsche.

11. Benutzen Sie diese Tablette, um auf ein SDS-PAGE Gel zu laufen. Sie können SDS Beispielbuffer (Proteinladenbuffer) diesem und Eingabe auf Gel hinzufügen, direkt nachdem Sie gekocht haben.

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