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Große wissenschaftliche Entdeckungen sind von den Männern gebildet worden, die suchen, ziemlich fehlerhafte Theorien über die Natur von Sachen zu überprüfen. ~Aldous Huxley, "Wordsworth in den Tropen"
1. Reagens: Das Probe Reagens wird gebildet, indem man Magnesium 100 von Coomassie blaues G250 in 50 ml 95% Äthanol auflöst. Die Lösung wird dann mit 100 ml 85% phosphoriger Säure gemischt und gebildet zu 1 L mit destilliertem Wasser. Das Reagens sollte durch Whatman Nr. 1 Filterpapier gefiltert werden und in einer bernsteinfarbigen Flasche bei der Raumtemperatur dann gespeichert werden. Es ist für einige Wochen beständig. Jedoch während dieser Zeit kann Färbung von der Lösung ausfällen und also sollte das gespeicherte Reagens vor Gebrauch gefiltert werden.
2. Proteinstandard. Rinderartiges Tier γ- Globulin bei einer Konzentration von 1 mg/mL (100 µg/mL für die Mikroanalyse) im destillierten Wasser wird als auf lagerlösung benutzt. Diesem sollte gespeichert werden eingefroren worden an –20oC. Da der Feuchtigkeitsgehalt des festen Proteins während der Speicherung schwanken kann, sollte die exakte Konzentration des Proteins in der Standardlösung von seiner Absorption bei 280 nm festgestellt werden. Die Absorption einer 1 mg/mL Lösung von γ- Globulin, in einem hellen Pfad 1-Zentimeter, ist 1.35. Die entsprechenden Werte für zwei alternative Proteinstandards, Tierserumalbumin und Ovalbumin, sind 0.66 und 0.75, beziehungsweise.
3. Der Plastik und Glaswaren, die in der Probe benutzt werden, sollten absolut sauber und Reinigungsmittel frei sein. Spektrofotometergießwannen des Quarzes (Silikon) sollten nicht benutzt werden, da die Färbung an dieses Material bindet. Spuren der Färbung Grenze zu den Glaswaren oder zum Plastik können durch das Ausspülen mit Methanol oder reinigender Lösung gelöscht werden.
1. Pipettieren Sie zwischen µg 10 und 100 des Proteins 100 µL im Gesamtdatenträger in ein Reagenzglas. Wenn die ungefähre Beispielkonzentration unbekannt ist-, prüfen Sie eine Strecke der Verdünnungen (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Bereiten Sie Duplikate jeder Probe vor.
2. Für die Eichkurve pipettieren Sie doppelte Datenträger 10, 20, 40, 60, 80 und 100 µL von 1 mg/mL γ- Globulinstandardlösung in Reagenzgläser, und bilden Sie jedes bis 100 µL mit destilliertem Wasser. Pipettieren Sie µL 100 des destillierten Wassers in ein weiteres Gefäß, um das Reagensleerzeichen zur Verfügung zu stellen.
3. Fügen Sie 5 ml des Proteinreagens jedem Gefäß hinzu und mischen Sie gut durch Umstellung oder mildern Sie das Vortexmixing. Vermeiden Sie zu schäumen, das zu schlechte Reproduzierbarkeit führt.
4. Messen Sie das A595 der Proben und der Standards gegen das Reagensleerzeichen zwischen 2 Minuten und 1 h, nachdem Sie gemischt haben. Der 100 µg Standard sollte einen Wert A595 von ungefähr 0.4 geben. Die Standardkurve ist nicht linear, und die exakte Absorption schwankt abhängig von dem Alter des Probe Reagens. Infolgedessen ist es wesentlich, eine Eichkurve für jedes Set Proben zu konstruieren.
Mikroanalyse-Methode dieses Formular der Probe ist für Protein empfindlicher. Infolgedessen ist es nützlich, wenn die Menge des unbekannten Proteins begrenzt wird (sehen Sie auch Anmerkung 9). 1. Pipettieren Sie die doppelten Proben, die zwischen µg 1 und 10 in einem Gesamtdatenträger µL 100 in Polyäthylen 1.5-mL microfuge Gefäße enthalten. Wenn die ungefähre Beispielkonzentration unbekannt ist-, prüfen Sie eine Strecke der Verdünnungen (1, 1:10, 1:100, 1:1000).
2. Für die Eichkurve pipettieren Sie doppelte Datenträger 10, 20, 40, 60, 80 und 100 µL von 100 µg/mL γ- Globulinstandardlösung in microfuge Gefäße, und justieren Sie den Datenträger auf µL 100 mit Wasser. Pipettieren Sie µL 100 des destillierten Wassers in ein Gefäß für das Reagensleerzeichen.
3. Fügen Sie 1 ml des Proteinreagens jedem Gefäß hinzu und mischen Sie leicht, aber gänzlich.
4. Messen Sie die Absorption jeder Probe zwischen 2 und 60 Minuten nach Hinzufügung des Proteinreagens. Der Wert A595 einer Probe, die µg 10 enthält γ- Globulin ist 0.45.
sehen Sie auch: Bradford Protein-Probe
Geändert vom Protokoll durch Nicholas J. Kruger.
Protein-Konzentration Protokoll
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