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Proteinmicroarray-Abfragungs-Methoden und Analyse

Proteinund AntikörperMicroarrays

Abfragungs-Methoden und Analyse für Protein-und Antikörper-Chips

Abfragungs-Methoden und unspezifische Schwergängigkeit
            Unspezifische Schwergängigkeit zur Reihe muss herabgesetzt werden und dieses wird gewöhnlich getan, indem man die Reihen in einem gegründeten Buffer des Rinderserumalbumins (BSA) untertaucht (31).
            das Parameter-Binden und die Speicherung auf Proteinreihen geht über den thermodynamisch angetriebenen verbindlichen Mechanismus über, der der Hybridation der Nukleinsäureziele zu den Prüfspitzen ähnlich ist.  Jedoch ist die Abfragung der verklemmten Ziele zu den Proteinen beträchtlich komplizierter als die von DNAmicroarrayabfragung (9).  Aktuell wird eine Vielzahl der Abfragungsmethoden überprüft.  Z.B. wurde ELISA zuerst verwendet, um Proteine für Filterreihen (66.67) und Glasreihen (68) zu entdecken.  ELISA gegründete Abfragungsmethoden haben den Nachteil der Nichtbesonderheit der Proteinantikörper Interaktionen und führen zu viele falschen Positive.   Die Radioisotopkennzeichnung wurde durch GE et al. (22), das Radioisotop verwendet, das beschriftet, um Proteinprotein, ProteinDNA, Proteindroge Interaktionen zu studieren auf Filterreihen.  Zhu benutzte et al. das Radioisotop, das beschriftet, um Kinaseproben der verschiedenen Substrate zu leiten, indem er gereinigte Hefekinaseproteine auf einer Reihe (6) verwendete.  Die bevorzugte Methode der Abfragung ist Fluoreszenzabfragung, weil diese Methoden im Allgemeinen sicher sind, extrem empfindlich, einfach und kann sehr hohe Auflösung haben.  Diese Abfragungsmethoden sind auch mit Standardmicroarrayscannern kompatibel. Im Allgemeinen ist ein Chip irgendein, das direkt mit einem Leuchtstoffmolekül geprüft wird (z.B. ein Leuchtstoff beschriftetes Protein oder ein kleines Molekül, durch die Anwendung einer etikettierten Prüfspitze (z.B. Biotin), das entdeckter Jobstepp unter Verwendung eines Leuchtstoff beschrifteten Affinitätsreagens (z.B. streptavidin) (16.56) dann sofort sein kann. Eine andere Leuchtstoff beschriftenmethode ist Rollenkreisverstärkung (RCA), die auch extrem empfindlich ist (32).  
            Obgleich die proteomes unter Vergleich auf eine vergleichbare Art und Weise mit fluorophores beschriftet werden können, ist die Reproduzierbarkeit dieser chemischen Reaktionen arm und Störung mit den Proteinantikörper Interaktionsgeschenken eine zusätzliche Kompliziertheit (9). Auch die nichtgleichförmiqe Kennzeichnung der Proteine kann adressiert werden, indem man eine Doppel-farbe ratiometric Probe durchführt, in der ein interner Standard für jedes Zielprotein anwesend ist, das (9) gemessen wird.          Ein Nachteil der beschriftenproteine mit fluorophores ist eine Verkleinerung der quantitativen Genauigkeit der Probe, da Gesellschaftsgründung des Kennsatzes die Bindefähigkeiten der Proteine ändern kann (9).

Obgleich beschriftenabfragungsmethoden des direkten Proteins noch am meisten benutzt sind, hat die tatsächlichen erwähnten Probleme den zunehmengebrauch von Abfragungsmethoden des Kennsatzes frei für Protein Microarrays ergeben.  Diese Methoden sind Massenspektrometrie (Mitgliedstaat), Atomkraftmikroskopie (Flughandbuch) (70) und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) (71). 
Nicht-beschriftenmethoden haben Vorteile als direkte Abfragungsannäherung für Antikörper Microarrays, da die Kennzeichnung der Moleküle Proteinaktivität beeinflußt. SELDI (Oberfläche-erhöhte Laser-Desorption/Ionisierung) Massenspektrometrie ist verwendet worden, um von geringer Dichte Reihen der erfassten Proteine (69) zu entdecken. Proteine werden auf einer Metalloberflächenreihe (SELDI Proteinreihe) erfasst und werden unter Verwendung eines Laserstrahl verdunstet.  Analyse unter Verwendung der Massenspektrometriedaten wird dann durchgeführt, um die Identitäten dieser Proteine aufzudecken.

            Topologische Änderungen der Atommethodengebrauch-Oberfläche der kraftmikroskopie (Flughandbuch), zum der erfassten Proteine auf einer Antikörperreihe (70) zu identifizierenen.  Wenn Kaninchen IgG auf einer Goldoberfläche stillgestellt wird und an seine höflichen Antikörper, Ziege Ameisekaninchen IgG, Flughandbuch bindet, entdeckt die Zunahme der Höhe, und ist folglich in der Lage Interaktionen, zu binden zu messen.  Gleichwohl, um die Kinetik der Antigenantikörper Interaktionen zu studieren, Echtzeitabfragungsmethoden nützlich sind.  Oberflächenplasmonresonanz (SPR) hat in ein vielseitig begabtes Abfragungshilfsmittel gereift, um die Kinetik der EmpfängerLigandinteraktionen mit einer großen Auswahl der Molekulargewicht, der Affinitäten und der verbindlichen Kinetik (72-74) zu studieren. Handels-SPR Chips sind jedoch ihre Abfragungsauflösung ist begrenzt vorhanden.  Eine Sensor-Oberfläche mit 64 einzelnen Immobilisierungsites in einer einflutigen Zelle wurde entwickelt (75).  Ein Antikörperreihe Biosensor wurde auch entwickelt, um die Kinetik des Antigens zu studieren binden unter Verwendung eines planaren Hohlleiters als die Abfragungsmethode. Unter Verwendung dieser Methode zeigte die Gruppe, dass bedeutende Signalintensität von den Punkten erzielt werden könnte, die im Durchmesser so klein sind wie 200 Millimeter. Es wird folglich erwartet, dass diese Annäherung für Hochdurchsatz und parallele Kinetikstudien verwendbar ist. (76).

Strecke der Abfragung
            Ein anderer Unterschied zwischen Protein und DNAmicroarrays ist, dass Proteinkonzentrationen in einer einzelnen biologischen Probe oder in den Zellen einige Ordnungen von magnitute größer als die für mRNAs sind.  So müssen ProteinSpänedetektorsysteme eine sehr große Strecke der Abfragungsoperation - bis zu einem Faktor von 1014 haben, verglichen bis 104 für mRNA.  So wird ein Antikörper mit nanomolar Affinität zu einem bestimmten Ziel durch das Vorhandensein dieses Ziels bei micromolar Konzentrationen gesättigt und nicht kann pico- oder femtomolar Zielstufen entdecken.  Die seltenen und reichlich vorhandenen Proteine so anpassen benötigt vermutlich unterschiedliche Reihen (7.8.9).
            Mehrfache Antikörper mit unterschiedlichen Affinitäten für das Ziel können an den verschiedenen Bereichen der Reihenjedoch Studien in Position gebracht werden haben gezeigt, dass nur 20% von gekleideten Antikörpern Messen der Proteine bei niedrigen Konzentrationen (33) zur Verfügung stellen. 

Zunächst: Protein-Produktion für Protein-Reihen

Referenzen für Proteinund AntikörperMicroarrays

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Einleitung und Hintergrund zu den Protein-Chips und zu den Antikörper-Chips.

Typen der Antikörper-und Protein-Chips

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