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Protein Microarray Abfragung Methoden und Analyse

Protein und Antikörper Microarrays

Abfragung Methoden und Analyse für Protein-und Antikörper-Chips

Abfragung Methoden und unspezifische Schwergängigkeit
            Unspezifische Schwergängigkeit zur Reihe muß herabgesetzt werden und dieses wird gewöhnlich getan, indem man die Reihen in einem gegründeten Buffer des Tierserums Albumin (BSA) untertaucht (31).
            das Parameter-Binden und die Speicherung auf Proteinreihen fährt über die thermodynamisch angetriebene verbindliche Einheit fort, die zur Hybridation der Nukleinsäureziele zu den Prüfspitzen ähnlich ist.  Jedoch ist die Abfragung der verklemmten Ziele zu den Proteinen beträchtlich komplizierter als die DNA der microarray Abfragung (9).  Aktuell wird eine Vielzahl der Abfragung Methoden überprüft.  Z.B. wurde ELISA zuerst verwendet, um Proteine für Filterreihen (66.67) und Glasreihen (68) zu entdecken.  ELISA gegründete Abfragung Methoden haben den Nachteil der Nichtbesonderheit der Protein-Antikörper Interaktionen und führen zu viele falsche Positive.   Das Radioisotopbeschriften wurde von Ge et al. verwendet. (22), Radioisotop, das beschriftet, um Protein- Protein–, Protein DNA–, Protein- Droge–interaktionen zu studieren auf Filterreihen.  Zhu et al.. benutztes Radioisotop, das beschriftet, um Kinaseproben der unterschiedlichen Substrate durch das Verwenden der gereinigten Hefekinaseproteine auf einer Reihe (6) zu leiten.  Die bevorzugte Methode der Abfragung ist Fluoreszenzabfragung, weil diese Methoden im Allgemeinen sicher sind, extrem empfindlich, einfach und kann sehr hohe Zerlegung haben.  Diese Abfragung Methoden sind auch mit microarray Standardscannern kompatibel. Im Allgemeinen ist ein Chip irgendein, das direkt mit einem Leuchtstoffmolekül geprüft wird (z.B. ein fluorescently beschriftetes Protein oder ein kleines Molekül, durch das Verwenden einer etikettierten Prüfspitze (z.B. Biotin), das in einem zweiten Jobstep mit einem fluorescently beschrifteten Affinität Reagens (z.B. streptavidin) (16.56) dann entdeckt werden kann. Eine andere Leuchtstoff beschriftende Methode ist Rollenkreisverstärkung (RCA), die auch extrem empfindlich ist (32).  
            Obgleich die proteomes unter Vergleich auf eine vergleichbare Art und Weise mit fluorophores beschriftet werden können, ist die Reproduzierbarkeit dieser chemischen Reaktionen schlecht und Störung mit den Protein-Antikörper Interaktionen Geschenken eine zusätzliche Kompliziertheit (9). Auch das nichtgleichförmiqe Beschriften der Proteine kann adressiert werden, indem man eine Doppel-Farbe ratiometric Probe durchführt, in der ein interner Standard für jedes Zielprotein anwesend ist, das (9) gemessen wird.          Ein Nachteil der beschriftenden Proteine mit fluorophores ist eine Verkleinerung der quantitativen Genauigkeit der Probe, da Gesellschaftsgründung des Kennsatzes die Bindefähigkeiten der Proteine ändern kann (9).

Obgleich beschriftende Methoden Abfragung des direkten Proteins noch allgemein verwendet werden, hat die tatsächlichen erwähnten Probleme den zunehmenden Gebrauch von Methoden Abfragung des Kennsatzes frei für Protein microarrays ergeben.  Diese Methoden sind Massenspektrometrie (MS), Atomkraftmikroskopie (Flughandbuch) (70) und Oberflächenplasmonresonanz (SPR) (71). 
Nicht-beschriftende Methoden haben Vorteile als direkte Abfragung Annäherung für Antikörper microarrays, da das Beschriften der Moleküle Proteinaktivität beeinflußt. SELDI (Oberfläche-erhöhter Laser desorption/ionization) Massenspektrometrie ist verwendet worden, um von geringer Dichte Reihen der erfaßten Proteine (69) zu entdecken. Proteine werden auf einer Metalloberfläche Reihe (SELDI Proteinreihe) erfaßt und werden mit einem Laserstrahl verdunstet.  Die Analyse, die Massenspektrometriedaten verwendet, wird dann durchgeführt, um die Identitäten dieser Proteine aufzudecken.

            AtomGebrauch-Oberfläche Methode der kraftmikroskopie (Flughandbuch) topologische Änderungen, zum der erfaßten Proteine auf einer Antikörperreihe (70) zu kennzeichnen.  Wenn Kaninchen IgG auf einer Goldoberfläche stillgestellt wird und an seine höflichen Antikörper, Ziege Ameise-Kaninchen IgG, Flughandbuch bindet, entdeckt die Zunahme der Höhe, und kann folglich Interaktionen, zu binden zu messen.  Gleichwohl, um die Kinetik der Antigen- Antikörper–interaktionen zu studieren, Echtzeitabfragung Methoden nützlich sind.  Oberflächenplasmonresonanz (SPR) hat in ein vielseitiges begabt Abfragung Hilfsmittel gereift, um die Kinetik der Empfänger ligand–Interaktionen mit einer breiten Strecke der Molekulargewichte, der Affinitäten und der verbindlichen Kinetik (72-74) zu studieren. Kommerzielle SPR Chips sind jedoch ihre Abfragung Zerlegung ist begrenzt vorhanden.  Eine Sensor-Oberfläche mit 64 einzelnen Immobilisierungsites in einer einzelnen Flußzelle wurde entwickelt (75).  Ein Antikörperreihe Biosensor wurde auch entwickelt, um die Kinetik des Antigens zu studieren binden mit einem planaren Hohlleiter als die Abfragung Methode. Mit dieser Methode zeigte die Gruppe, daß bedeutende Signalintensität von den Punkten erzielt werden könnte, die im Durchmesser so klein sind wie 200 Millimeter. Es wird folglich erwartet, daß diese Annäherung für Hochdurchsatz und parallele Kinetikstudien verwendbar ist. (76).

Strecke der Abfragung
            Ein anderer Unterschied zwischen Protein und DNA microarrays ist, daß Proteinkonzentrationen in einer einzelnen biologischen Probe oder in den Zellen einige Ordnungen von magnitute grösser als die für mRNAs sind.  So müssen Proteinspänedetektorsysteme eine sehr große Strecke der Abfragung Operation bis zu – einem Faktor von 1014 haben, verglichen bis 104 für mRNA.  So wird ein Antikörper mit nanomolar Affinität zu einem bestimmten Ziel durch das Vorhandensein dieses Ziels bei micromolar Konzentrationen gesättigt und nicht kann pico- oder femtomolar Zielstufen entdecken.  Die seltenen und reichlich vorhandenen Proteine so anpassen benötigt vermutlich unterschiedliche Reihen (7.8.9).
            Mehrfache Antikörper mit unterschiedlichen Affinitäten für das Ziel können an den unterschiedlichen Bereichen der Reihe jedoch Studien in Position gebracht werden haben gezeigt, daß nur 20% von gekleideten Antikörpern Messen der Proteine bei niedrigen Konzentrationen (33) zur Verfügung stellen. 

Zunächst: Protein-Produktion für Protein-Reihen

Referenzen für Protein und Antikörper Microarrays

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Einleitung und Hintergrund zu den Protein-Chips und zu den Antikörper-Chips.

Typen der Antikörper-und Protein-Chips