Erfolgreiche PCR-Zustände

Parameter für erfolgreichen PCR

Werden Ihnen Probleme des Erzielens eines erfolgreichen PCR gehabt?  Viele Faktoren können Ihr Resultat Ihres PCR wie beeinflussen: Metallionenadjunkten, Substrat und Substrat-Entsprechungen, Buffer und Salze und Cosolvents.  Auch thermisches Radfahren-Erwägungen:  Pcr-Behälter, Temperatur-und Zeit-Optimierung, PCR-Verstärkungs-Schleifen, Enzym/Ziel und Heißstart. 

Metallionenadjunkten und PCR

Eine wesentliche Adjunkte für die DNA-Polymerase in PCR ist Magnesiumchlorverbindung.  Seine Konzentration muss für jede Zündkapsel optimiert werden: Schablonensystem. Viele Bestandteile des Reaktionsbindungs-Magnesiumions, einschließlich Zündkapseln, Schablone, PCR-Produkte und dNTPs. Das Bindemittel des Haupt1:1 für Magnesiumion ist die hohe Konzentration von dNTPs in der Reaktion. Weil es notwendig für freies Magnesiumion ist, als Enzymadjunkte in PCR zu dienen, muss die Gesamtmagnesiumionenkonzentration die GesamtdNTP Konzentration übersteigen. Gewöhnlich den Optimierungsprozeß zu beginnen, wird 1.5 Millimeter Magnesiumchlorverbindung PCR in Anwesenheit 0.8 Millimeter der GesamtdNTPs hinzugefügt. Dieses lässt ungefähr 0.7 Millimeter freien Magnesium für die DNA-Polymerase. Im Allgemeinen sollte Magnesiumion in eine Konzentrationsserie von 1.5-4.0 Millimeter in den 0.5 Millimeter-Jobstepps unterschieden werden.

Substrate und Substrat-Entsprechungen für PCR

Die DNA-Polymerasen enthalten sehr leistungsfähig dNTPs.  Sie können geänderte Substrate auch enthalten, wenn sie als zusätzliche Bestandteile in PCR benutzt werden. Beispiele der Substrate, die für DNA-Polymerase benutzt werden, sind: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP und Leuchtstoff beschriftete dNTPs. Für herkömmlichen PCR bleibt die Konzentration von dNTPs in den Equimolar- Verhältnissen z.B. μM 200 jedes dNTP ausgeglichen. Beachten Sie auch das, Abweichungen von diesen Standardempfehlungen kann in bestimmten amplications vorteilhaft sein. Z.B. wenn gelegentliche Mutagenese eines spezifischen Ziels gewünscht wird, fördern unausgeglichene dNTP Konzentrationen einen höheren Grad an misincorporations durch die DNA-Polymerase.

Buffer und Salze für PCR

Abhängig von der DNA-Polymerase verwendete die optimale PCR-Bufferkonzentration, Salzkonzentration, und pH sollte zur DNA-Polymerase dementsprechend ausgewählt werden. Der pcr-Buffer für Taq DNA-Polymerase besteht 50 Millimeter KCl und aus 10 Millimeter Tris-HCl, pH 8.3, bei Zimmertemperatur. Dieser Buffer liefert die Ionenstärke und die Dämpfungsfähigkeit, die während der Reaktion benötigt werden. Es ist wichtig, zu beachten, dass die Salzkonzentration das TM der Zündkapsel beeinflußt: Schablonenduplex und folglich die Ausglühentemperatur.

Cosolvents

Unterschiedlicher PCR Cosolvents werden verwendet, um den Ertrag, die Wirksamkeit und die Besonderheit der PCR-Verstärkungen zu erhöhen. Diese cosolvents können in anderen Verstärkungen vorteilhaft in einigen Verstärkungen, und nachteilig sein. Es ist unmöglich, vorauszusagen, welcher Zusatz für jede Zündkapsel nützlich ist: Schablonenduplex und folglich das cosolvent muss auf jede Kombination empirisch geprüft werden.

Thermisches Radfahren-Erwägungen

Pcr-Behälter

PCR muss in den Behältern durchgeführt werden, die mit niedrigen Mengen Enzym und Nukleinsäuren kompatibel sind und die gute thermische Übergangseigenschaften haben. Normalerweise wird Polypropylen für PCR-Behälter benutzt und herkömmliche, dickwandige microcentrifuge Gefäße werden für viele thermischen cycler Systeme gewählt. PCR wird häufig an einer μL 10-100 Reaktionsskala durchgeführt und die Verhinderung der Verdampfung-/Kondensationprozesse im geschlossenen Reaktionsgefäß während des thermischen Radfahrens benötigt. Eine Mineralöltestblatt- oder Wachsschicht dient diesen Zweck. Vor kurzem, sind dünnwandige Behälter 0.2-mL für den PCR-Prozess optimiert worden und ölfreie thermische cyclers sind konzipiert worden, die eine erhitzte Abdeckung über den Gefäßen benutzen, die innerhalb des Beispielblockes angehalten werden.

Temperatur-und Schleife-Zeit-Optimierung

Es ist wesentlich, dass die Reaktionsgemische die Denaturierung, das Ausglühen und die Extensionstemperaturen in jeder thermischen Schleife erreichen. Wenn unzulängliche Haltezeit bei irgendeiner Temperatur spezifiziert wird, wird die Temperatur der Probe nicht mit der des Beispielblockes abgeglichen. Etwas thermisches cycler konzipiert Zeit, die der Einflussabstand auf der Blocktemperatur gründete, während andere die Haltezeit auf vorausgesagter Beispieltemperatur gründen. Wenn ein herkömmliches dickwandiges Gefäß, das in einem cycler gesteuert wird durch Blocktemperatur, eine 60 s-Haltezeit benutzt wird, für Gleichgewichtherstellung genügend ist. Verlängerung kann an empfohlen werden (72°C) Extensionsjobstep für längere PCR-Produkte. Unter Verwendung eines dünnwandigen Gefäßes 0.2-mL in einem cycler, das durch vorausgesagte Beispieltemperatur gesteuert wird, nur wird 15 s benötigt. Um vorhandene Protokolle oder zu den Entwicklungsprotokollen für Gebrauch an den mehrfachen Labors zu verwenden, ist es sehr wichtig Haltezeiten entsprechend der cycler Entwurfs- und GefäßWandstärke zu beschließen.

Pcr-Verstärkungs-Schleife-Zahl

Die Zahl PCR-Verstärkungsschleifen sollte in Bezug auf die beginnende Konzentration der Ziel DNA optimiert werden. Es wird empfohlen, dass, von 40 - 45 Schleifen, zum von 50 Zielmolekülen zu verstärken und 25-30 cht einen Kreislauf durchma, um 3 × 105 Moleküle zur gleichen Konzentration zu verstärken. Diese Nichtproportionatität wird durch einen so genannten Hochebeneeffekt verursacht, in dem eine Abnahme an der exponentialen Kinetik der Produktaufspeicherung in den späten Stadien eines PCR auftritt. Dieses kann durch Verminderung der Reaktionsmittel (dNTPs, Enzym) verursacht werden; Reaktionsmittelentleerung (Zündkapseln, dNTPs); Endprodukthemmung (Pyrophosphatanordnung); Konkurrenz für Reaktionsmittel durch unspezifische Produkte; oder Konkurrenz für die Zündkapsel, die durch das Reannealing des starken bindet (10 Nanometer) Produktes. Es ist normalerweise ratsam, die Mindestzahl der Schleifen laufen zu lassen, die benötigt werden, um das gewünschte spezifische Produkt zu sehen, weil unerwünschte unspezifische Produkte behindern, wenn die Zahl Schleifen übertrieben ist.

 Enzym/Ziel

In einer Standardaliquote der Taq DNA-Polymerase, die für eine 100 μL Reaktion benutzt wird, gibt es ungefähr 1010 Moleküle. Jede PCR-Probe sollte für die Zahl Zielexemplaren ausgewertet werden, die sie enthalten enthält oder kann. Z.B. enthält 1 ng Lambda DNA 1.8 × 107 Exemplare. Für Niedriginput Exemplarzahl PCR wird das Enzym begrenzend und es kann notwendig sein, dem Extensionsprozeß mehr Zeit Inkremental- zu geben. Thermische cyclers können diese automatische Segmentextensionsprozedur zuverlässig durchführen, um PCR-Ertrag zu maximieren.

Heißstart-Zustände

Alle oben genannten Optimierungen treffen auch auf einen PCR zu, der, vom Anfang, mit einer Heißstartmethode konzipiert ist. Häufig kann ein Heißstart in einen vorher optimierten PCR erfolgreich enthalten werden, ohne die Reaktionszustände zu ändern. Jedoch zahlt er normalerweise, reoptimize, nachdem er einen Heißstart hinzugefügt hat. Optimierung ist häufig eine Balance zwischen dem Produzieren so vielen Produktes, wie möglich und dem Überproduzieren unspezifisch, Hintergrundverstärkungen. Weil Heißstart groß Hintergrundverstärkungen verringert, werden die oberen Begrenzungen auf Bedingungen wie Enzymkonzentration, Schleifezahl und Metallionenadjunktekonzentration angehoben. Empfindliches PCRs, das in hohem Grade ohne einen Heißstart justiert worden sind, kann ausfallen, wenn ein Heißstart hinzugefügt wird. Dieses kann durch geringfügige Verzögerungen in den frühen Schleifen verursacht werden, die durch das Mischen oder Enzymaktivierung verursacht werden. Der PCR kann, häufig mit erheblicher Zunahme des spezifischen Produktes normalerweise zurückgestellt werden, durch einfach sich erhöhen, Parameter oder Reagenzien begrenzend. Zusätzlich gibt es die Optimierungen, die zu jeder Heißstartmethode spezifisch sind. Das Mischen oder die Enzymaktivierung können durch PCR-Datenträger, Bufferaufbau und pH, cosolvents, einen.Kreislauf.durchmachenbedingungen beeinflußt werden, und so weiter. Die spezifischen Literatur des Produktes, häufig ein Produkteinsatz, sollte zu Information über diese Erwägungen konsultiert werden.