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Erfolgreiche PCR Zustände

Parameter für erfolgreiches PCR

Werden Ihnen Probleme des Erzielens eines erfolgreichen PCR gehabt?  Viele Faktoren können Ihr Resultat Ihres PCR wie beeinflussen: Metallionenadjunkten, Substrat und Substrat-Entsprechungen, Buffer und Salze und Cosolvents.  Auch Thermische Einen.Kreislauf.durchmachenerwägungen:  PCR Behälter, Temperatur-und Zeit-Optimierung, PCR Verstärkung Schleifen, Enzyme/Target und Heißstart. 

Metallionenadjunkten und PCR

Eine wesentliche Adjunkte für die DNA Polymerase in PCR ist Magnesiumchlorverbindung.  Seine Konzentration muß für jedes primer:template System optimiert werden. Viele Bestandteile der Reaktion binden Magnesiumion, einschließlich Zündkapseln, Schablone, PCR Produkte und dNTPs. Das Haupt1:1 Bindemittel für Magnesiumion ist die hohe Konzentration von dNTPs in der Reaktion. Weil es notwendig für freies Magnesiumion ist, als Enzymadjunkte in PCR zu dienen, muß die Gesamtmagnesiumionenkonzentration die GesamtdNTP Konzentration übersteigen. Gewöhnlich den Optimierung Prozeß zu beginnen, wird 1.5 Millimeter Magnesiumchlorverbindung PCR in Anwesenheit 0.8 Millimeter der GesamtdNTPs hinzugefügt. Dieses läßt ungefähr 0.7 Millimeter freien Magnesium für die DNA Polymerase. Im allgemeinen sollte Magnesiumion in eine Konzentration Serie von 1.5 4.0–Millimeter in den 0.5 Millimeter Jobsteps verändert werden.

Substrate und Substrat-Entsprechungen für PCR

Die DNA Polymerasen enthalten sehr leistungsfähig dNTPs.  Sie können geänderte Substrate auch enthalten, wenn sie als zusätzliche Bestandteile in PCR benutzt werden. Beispiele der Substrate, die für DNA Polymerase benutzt werden, sind: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP und fluorescently beschriftete dNTPs. Für herkömmliches PCR kann die Konzentration von dNTPs Remains ausgeglichen in Equimolar- Verhältnissen z.B. μ200 M, das jedes dNTP. auch das, Abweichungen von diesen Standardempfehlungen beachten, in bestimmten amplications vorteilhaft sein. Z.B. wenn gelegentliche Mutagenese eines spezifischen Ziels gewünscht wird, fördern unausgeglichene dNTP Konzentrationen einen höheren Grad misincorporations durch die DNA Polymerase.

Buffer und Salze für PCR

Abhängig von DNA verwendete die Polymerase die optimale PCR Bufferkonzentration, Salzkonzentration, und pH sollte zur DNA Polymerase dementsprechend ausgewählt werden. Der PCR Buffer für Taq DNA Polymerase besteht aus 50 Millimeter KCl und 10 Millimeter Tris-HCl, pH 8.3, bei der Raumtemperatur. Dieser Buffer liefert die Ionenstärke und die Dämpfungsfähigkeit, die während der Reaktion benötigt werden. Es ist wichtig, zu beachten, daß die Salzkonzentration das Tm des primer:template Duplex beeinflußt, und folglich die Ausglühentemperatur.

Cosolvents

Unterschiedliche PCR Cosolvents werden verwendet, um das Ergebnis, die Wirksamkeit und die Besonderheit der PCR Verstärkungen zu erhöhen. Diese cosolvents können in anderen Verstärkungen vorteilhaft in einigen Verstärkungen, und nachteilig sein. Es ist unmöglich, vorauszusagen, daß welcher Zusatz für jedes primer:template Duplex und folglich das cosolvent nützlich ist, muß auf jede Kombination empirisch geprüft werden.

Thermische Einen.Kreislauf.durchmachenerwägungen

PCR Behälter

PCR muß in den Behältern durchgeführt werden, die mit niedrigen Mengen Enzym und Nukleinsäuren kompatibel sind und die gute thermische Übergangseigenschaften haben. Normalerweise wird Polypropylen für PCR Behälter benutzt und herkömmliche, dickwandige microcentrifuge Gefäße werden für viele thermische cycler Systeme gewählt. PCR wird häufig an einem 10 100–L μReaktion Skala durchgeführt und die Verhinderung der evaporation/condensation Prozesse im geschlossenen Reaktion Gefäß während des thermischen Radfahrens benötigt. Eine Mineralöltestblatt- oder -wachsschicht dient diesen Zweck. Vor kurzem, sind dünnwandige Behälter 0.2-mL für den PCR Prozeß optimiert worden und ölfreie thermische cyclers sind konzipiert worden, die eine lebhafte Abdeckung über den Gefäßen benutzen, die innerhalb des Beispielblockes angehalten werden.

Temperatur-und Schleife-Zeit-Optimierung

Es ist wesentlich, daß die Reaktionsgemische die Denaturierung, Ausglühen und Extension Temperaturen in jeder thermischen Schleife erreichen. Wenn unzulängliche Haltezeit bei irgendeiner Temperatur spezifiziert wird, wird die Temperatur der Probe nicht mit der des Beispielblockes abgeglichen. Etwas thermisches cycler konzipiert Zeit, die der Einflußabstand auf der Blocktemperatur gründete, während andere die Haltezeit auf vorausgesagter Beispieltemperatur gründen. Wenn ein herkömmliches dickwandiges Gefäß, das in einem cycler gesteuert wird durch Blocktemperatur, eine 60-s Haltezeit benutzt wird, für Gleichgewichtherstellung genügend ist. Extrazeit kann am Extension (72°C) Jobstep empfohlen werden für längere PCR Produkte. Mit einem dünnwandigen Gefäß 0.2-mL in einem cycler, das durch vorausgesagte Beispieltemperatur gesteuert wird, nur wird 15 s benoetigt. Um vorhandene Protokolle oder zu den Entwicklung Protokollen für Gebrauch an den mehrfachen Labors zu verwenden, ist es sehr wichtig Haltezeiten entsprechend der cycler Design- und Gefäßwandstärke zu beschließen.

PCR Verstärkung Schleife-Zahl

Die Zahl PCR Verstärkung Schleifen sollte in Bezug auf die beginnende Konzentration der Ziel DNA optimiert werden. Es wird daß, von 40 45– Schleifen empfohlen, um 50 Zielmoleküle zu verstärken und von 25–30 Schleifen, um 3 105 × Moleküle zur gleichen Konzentration zu verstärken. Diese Nichtproportionatität wird durch einen sogenannten Hochebeneeffekt verursacht, in dem eine Abnahme an der exponentialen Kinetik der Produktaufspeicherung in den späten Stadien eines PCR auftritt. Dieses kann durch Verminderung der Reaktionsmittel (dNTPs, Enzym) verursacht werden; Reaktionsmittelentleerung (Zündkapseln, dNTPs); Endprodukthemmung (Pyrophosphatanordnung); Konkurrenz für Reaktionsmittel durch unspezifische Produkte; oder Konkurrenz für die Zündkapsel, die durch das Reannealing des starken bindet (10 nM) Produktes. Es ist normalerweise ratsam, die Mindestzahl der Schleifen laufen zu lassen, die benötigt werden, um das gewünschte spezifische Produkt zu sehen, weil unerwünschte unspezifische Produkte behinderen, wenn die Zahl Schleifen übertrieben ist.

 Enzym/Ziel

In einer Standardaliquote der Taq DNA Polymerase, die für ein 100 LμReaktion benutzt wird, gibt es ungefähr 1010 Moleküle. Jede PCR Probe sollte für die Zahl Zielexemplaren ausgewertet werden, die sie enthalten enthält oder kann. Z.B. enthält 1 ng Lambda DNA 1.8 × 107 Exemplare. Für Niedriginput Exemplarzahl PCR, wird das Enzym, begrenzend und es kann notwendig sein, dem Extension Prozeß mehr Zeit Inkremental- zu geben. Thermische cyclers können diese automatische Segmentextension Prozedur zuverlässig durchführen, um PCR Ergebnis zu maximieren.

Heißstart-Zustände

Alle oben genannten Optimierungen treffen auch auf ein PCR zu, das, vom Anfang, mit einer Heißstartmethode konzipiert ist. Häufig kann ein Heißstart in ein vorher optimiertes PCR erfolgreich enthalten werden, ohne die Reaktion Zustände zu ändern. Jedoch zahlt er normalerweise reoptimize, nachdem er einen Heißstart hinzugefügt hat. Optimierung ist häufig eine Balance zwischen dem Produzieren so vielen Produktes, wie möglich und dem Overproducing unspezifisch, Hintergrundverstärkungen. Weil Heißstart groß Hintergrundverstärkungen verringert, werden die oberen Begrenzungen auf Bedingungen wie Enzymkonzentration angehoben, Zahl und Metallionenadjunktekonzentration einen Kreislauf durchmachen. Empfindliches PCRs, das in hohem Grade ohne einen Heißstart justiert worden sind, kann ausfallen, wenn ein Heißstart hinzugefügt wird. Dieses kann durch geringfügiges verursacht werden verzögert in den frühen Schleifen, die durch das Mischen oder Enzymaktivierung verursacht werden. Das PCR kann, häufig mit erheblicher Zunahme des spezifischen Produktes normalerweise wiederhergestellt werden, durch einfach sich erhöhen, Parameter oder Reagenzien begrenzend. Zusätzlich gibt es die Optimierungen, die zu jeder Heißstartmethode spezifisch sind. Das Mischen oder die Enzymaktivierung können durch PCR Datenträger, Bufferaufbau und pH, cosolvents, einen.Kreislauf.durchmachenbedingungen beeinflußt werden und so weiter. Die spezifische Literatur’des Produktes s, häufig ein Produkteinsatz, sollte zu Information über diese Erwägungen beraten werden.