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Polymerase-Kettenreaktion Site-Mutagenese

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Fangen Sie zuerst mit einem Plasmid an, das ein Gen mit einem TAC Tyrosin codon enthält, das wir zu einem TTC Phenylalanin codon ändern möchten. In der Ordnung, zum dieses zu vollenden müssen wir am Paar (blau) in der Vorlage zu einem T-A Paar ändern. Dieses Plasmid wurde von einer normalen Belastung von E.coli lokalisiert, das ab GATC Reihenfolgen methyliert. Die Methyl- Gruppen werden im Gelb angezeigt. Die folgenden Jobsteps werden durchgeführt, um dieses zu vollenden:

• Erhitzen Sie das Plasmid, um seine Fasern zu trennen.
• Wir tempern dann mutagene Zündkapseln, die das TTC codon enthalten, oder seine Rückergänzung, GAA. Die geänderte Unterseite in jeder Zündkapsel wird im Pink angezeigt.
• Wir führen dann einige Umläufe von PCR durch (über 8) mit den mutagenen Zündkapseln, zum des Plasmids mit dem geänderten codon zu verstärken. Wir benutzen eine hitzebeständige DNA Polymerase, wie Pfu Polymerase, um Fehler herabzusetzen, wenn wir das Plasmid kopieren.
• Wir behandeln dann die DNA in der PCR Reaktion mit DpnI, um den methylierten Wildtypen DNA zu verdauen. Da das PCR Produkt in-vitro gebildet wurde, wird es nicht methyliert und wird nicht geschnitten. Zuletzt wandeln wir E. Coli Zellen mit der behandelten DNA um. Prinzipiell nur die veränderte DNA überlebt, um umzuwandeln. Dieses wird, indem man die Plasmid DNA von mehreren sequentiell ordnet, klont überprüft.



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