Pcr-Polymerasen

Die rechte DNA-Polymerase wählend, wird durch die Ziele des Experimentes festgestellt. Es gibt eine beträchtliche Menge handelsübliche anzymes, zum von diesem zu wählen sich unterscheiden in ihrem processivity, in Wärmebeständigkeit und in Treue. Das geläufigste benutzte Enzym ist Taq DNA-Polymerase alias Handels- wie, AmpliTaq® DNA-Polymerase.

AmpliTaq DNA-Polymerase

AmpliTaq DNA-Polymerase ist ein in hohem Grade gekennzeichnetes recombinant Enzym für PCR. Produziert in Escherichia Coli aus dem Taq DNA-Polymerasegen, große Reinheit so zusichernd. Sie wird geläufig als 5 U/μL Lösung in gepuffertem 50% angegeben und verwendet (v/v) Glyzerin.

Körperliches Properities: Das Enzym ist ein kDa 94 Protein mit einer Aktivität der Polymerisierung 5 ' - 3 ', die in der Strecke 70°-80°C am leistungsfähigsten ist. Es ist, mit eine Halbwertzeit an 95°C von 35-40 Min. in dem thermischen Radfahren ausgedrückt, die Halbwertzeit ist ca. 100 Schleifen unglaublich hitzebeständig. Pcr-Produkte unter Verwendung dieses Enzyms haben einzelne niedrige Überhänge an den 3 ' Enden jedes polymerisierten Stranges (dieses kann für Gebrauch mit T/A Klonenvektoren ausgenutzt werden).

Bioreaktionen: DNA-Polymerase benötigt Magnesiumion als Adjunkte und katalysiert die Extensionsreaktion einer vorbereiteten Schablone an 72°C. Die vier dNTPs werden benutzt, um die Zündkapsel auszudehnen und therby, um die Zielreihenfolge zu kopieren. Auch geänderte Nukleotide können in PCR-Produkte enthalten werden.

Aktivitäten: Dieses Enzym hat a Gabel-wie Strukturabhängiger, die erhöhte Polymerisierung, Aktivität der Nuklease 5 ' - 3 '. Die Aktivität, die es besitzt, erlaubt, welches sie, vermindern Ti stromabwärts gerichtete Zündkapseln und zeigten an, dass circuka Ziele vor Verstärkung linearisiert werden sollten. Auch diese Nukleaseaktivität ist in einer Leuchtstoff Signal-festlegentechnik für PCR-quantitative Bestimmung eingesetzt worden. Dieses Enzym hat nicht eine zugehörige exonuclease 3 ' - 5 ' oder Korrekturlesenaktivität, aber produziert amplicons des hohen Ertrags für die meisten Anwendungen.

AmpliTaq Goldpolymerase

Dieses Enzym ist eine chemisch geänderte AmpliTaq DNA-Polymerase, die umschaltbare Änderung hält das Enzym unaktiviert bei Zimmertemperatur. Hochtemperatur- und mit niedrigem pH-Wert fördern Sie die Umlenkung und die Enzymaktivität zurückstellen. Diese Bedingungen treten in einem Tris-gepufferten PCR an 92°-95°C auf (Tris-Cl formulierte zu pH 8.3 an den Tropfen 25°C unterhalb pH 7.0 über 90°C). AmpliTaq Gold wird formuliert, um die selben wie 5 U/μL AmpliTaq durchzuführen DNA-Polymerase. Folglich kann ein Heißstart dem meisten PCRs hinzugefügt werden, das mit AmpliTaq DNA-Polymerase optimiert wird, indem man AmpliTaq Gold ersetzt und eine 10 Minute, 95°C, vor-PCR, Aktivierungsjobstep hinzufügt.

Die gleichen Resultate können ohne den Jobstepp der Aktivierung erzielt werden vor-PCR, indem man zusätzlichen 10 hinzufügt oder mehr PCR-Schleifen. Unter diesen Bedingungen ist das Enzym Inkremental- während der PCR-Denaturierungjobsteps aktiviert.

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