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Copyright MolecularStation 2006
Polymerase-Kettenreaktion - PCR
Inhaltsverzeichnis:
Einleitung in ein PCR - Polymerase-Kettenreaktion
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
PCR, ein entdeckt zu werden Konzept
Allgemeine Grundregeln des PCR
Polymerases/Reaction Besonderheit und Leistungsfähigkeit
Misincorporation: Fehler der in-vitro systeme
Wird PCR überhaupt ersetzt? – Helicase-abhängige Verstärkung (HDA)
Vor mehr als 30 Jahren, die Einleitung der recombinant DNA Technologie, wie ein Hilfsmittel für die biologischen Wissenschaften die Studie des Lebens revolutionierte. Molekulares Klonen erlaubte die Studie der einzelnen Gene der lebenden organismen; jedoch war diese Technik vom Erhalten einer verhältnismäßig großen Quantität reiner DNA abhängig. Dieses hing von der Reproduktion der DNA der Plasmide oder anderer Vektoren während der Zellteilung der Mikroorganismen (1) ab. Forscher fanden es extrem mühsam und schwierig, eine spezifische DNA in der Quantität von der Masse der Gene zu erhalten, die in einer biologischen Probe (2) vorhanden sind. Recombinant DNA Technologie ermöglichte die erste molekulare Analyse und die prenatale Diagnose von einigen menschlichen Krankheiten. Fötale DNA, die durch Amniocentesismusterstück erhalten wurde, konnte durch Beschränkung Enzymverdauung, Elektrophorese, südliche Übertragung und Hybridation zu einem geklonten Gen oder zu den Oligonucleotideprüfspitzen analysiert werden (3). Jedoch ermöglichte das südliche Beflecken rudimentäres der Gene in ohne Bezugeinzelpersonen nur abbilden (4).
PCR, ein Akronym für Polymerase-Kettenreaktion
(5.6), erlaubte die Produktion der großen Quantitäten einer
spezifischen DNA von einer komplizierten DNA Schablone in einer
einfachen enzymatischen Reaktion. PCR ist eine vor
kurzem entwickelte Prozedur für die in-vitro verstärkung von DNA. PCR hat die Methode umgewandelt, der fast alles das
Benötigen der Handhabung der DNA Fragmente kann als durchgeführt
werden Resultate seiner Einfachheit und Verwendungsfähigkeit (7)
studiert.
In den achtziger Jahren Kary Mullis (Abbildung 1) und ein Team
von den Forschern an Cetus Corporation an Cetus Corporation begriffen
von einer Methode, die Tätigkeit einer Polymerase an den spezifischen
Punkten entlang einer einzelnen Faser von DNA zu beginnen und zu
stoppen. Mullis stellte auch fest, daß, indem man
diesen Bestandteil der molekularen Wiedergabetechnologie vorspannte,
die Ziel DNA exponential verstärkt werden könnte. Diese DNA Verstärkung Prozedur basierte auf einem
in-vitro- anstatt in vivo Prozeß (5.6.8). Zellfreie DNA
Verstärkung durch PCR konnte, viele der Standardprozeduren für
Klonen und analysierte und der ändernden Nukleinsäuren zu
vereinfachen (1). Vorhergehende Techniken für das
Lokalisieren eines spezifischen Stückes DNA beruhten auf dem Gen, das
eine – langwierige und langsame Prozedur klont. PCR, andererseits Kerry angegebenes Mullis “läßt Sie das Stück von DNA innen auswählen’Sie bezüglich interessierten und so viel von ihm haben,
während Sie wünschen” (2.8). Wenn andere
Cetus Wissenschaftler, die schließlich gefolgt werden, mit, die
Polymerase Kettenreaktion zu bilden, durchführen, wie gewünscht in
einer zuverlässigen Art und Weise, hatten sie eine unermeßlich
leistungsfähige Technik für unbegrenzte Quantitäten der exakten
genetischen materiellen molekularen Biologen und der anderer im
Wesentlichen zur Verfügung stellen, die für ihre Arbeit (8)
benötigt wurden. Seit dem ersten Report in1985, wurden
mehr als 5000 wissenschaftliche Papiere durch 1992 (1)
veröffentlicht. Ausserdem bildet the.large.number.of
Publikationen es selbstverständlich unmöglich, alle wichtigen
Beiträge zur Entwicklung und zur Anwendung der PCR Technologie zu
wiederholen; jedoch versuchen wir, die wichtigsten Entwicklungen
in der Praxis grundlegenden PCR hier zu wiederholen.
PCR wurde gedacht, durch Dr. Kerry Mullis
begriffen zu werden in 1983 beim Arbeiten an Cetus Corporation in
Emeryville, Ca. Jedoch wurde etwas bahnbrechende Arbeit
auch von Gobind Khorana 1971 erledigt, wer ein Grundprinzip des
Wiederholens eines Stückes DNA mit zwei Zündkapseln beschrieb. Fortschritt dann wurde durch besser gekleidetere
Synthese- und Polymerasereinigungausgaben (9) begrenzt. Mullis’s im Kopf wuchs die Erfindung von
einem theoretischen Entwurf, um das begrenzte dideoxynucleotide
Sequentiell ordnen der eindeutigen menschlichen Gene mit synthetischen
Oligonucleotides für bestimmende geläufige menschliche
Krankheitveränderungen durchzuführen. Ein
offensichtliches Hindernis zu solch einer direkter sequentiell
ordnender Strategie war die hohe Kompliziertheit der menschlichen
niedrigen Paare des Genoms (3.3 x 109). So wurden ein
zweiter Oligonucleotide oder eine Zündkapsel hinzugefügt, um die
Weiterentwicklung der Synthese der ersten Zündkapsel zu blocken. Später jedoch, war diese zweite Zündkapsel
eingeschlossen, um an die andere DNA Faser zu binden, damit jede Faser
des Durch Mutation entstehende Variation Allels zum etwaigen Signal
beitragen würde. Wenn der Entwurf, der simultane
Hybridation der Zündkapseln zu jeder Faser mit einbezieht, durch die
Heizung der Mischung und das Ausglühen und die Extension Jobsteps
dann wiederholen geändert wurde, dann würde das Primärsignal
erhöhtes sogar weiteres sein. Das Wiederholen der
Jobsteps würde die Produkte des ersten Umlaufes aktivieren, in der
zweiten Schleife kopiert zu werden, um zwei Exemplare zu erbringen. Das Wiederholen der Schleife wieder würde vier
Exemplare und cetera ergeben. Einige Wochen, die vor dieser großen Idee
geführt wurden, wurden (8) versucht. Zwei Zündkapseln
wurden synthetisiert, um zu jedem Ende der niedrigen Region des Paares
110 eines geklonten Segments des menschlichen b-globin Gens tadellos
ergänzend zu sein, wurde die Verstärkung durchgeführt, und die
Produkte wurden durch Acrylamidgelelektrophorese gekennzeichnet. Das Ende Resultat war das vorweggenommene niedrige Paar
110 DNA Fragment und der Anfang von PCR als grundlegende Technik in
der molekularen Biologie (5.6).
In Mulliss ursprünglichem PCR process(5,6,8), wurde das Enzym
in vitro benutzt (in
einer kontrollierten Umgebung außerhalb eines Organismus). Die double-stranded DNA wurde in zwei einzelne Fasern
getrennt, indem man es zu 96°C erhitzte. Bei dieser
Temperatur jedoch wurde die E.Coli DNA Polymerase zerstört, damit das Enzym
nach dem Heizung Stadium jeder Schleife ergänzt werden mußte. War ursprünglicher Prozeß PCR Mulliss sehr
wirkungslos, da er viel Zeit, beträchtliche Mengen der DNA-Polymerase
und kontinuierliche Aufmerksamkeit während des PCR Prozesses
benötigte.
Prüfung der PCR Verstärkung Einheit decken
seine Einfachheit aber auch seine Eleganz auf (Abbildung 2). Oligonucleotidezündkapseln sind zuerst konzipiert, um
zu den Enden der im molaren Überfluß mit der DNA Schablone
verstärkt zu werden, und dann gemischt worden Reihenfolge ergänzend
zu sein, und in den deoxyribonucleotides in einem passenden Buffer. Folgende Heizung, zum der Vorlage Fasern und des
Abkühlens zu denaturieren, um besser gekleideteres Ausglühen, die
Oligonucleotides zu fördern jede Bindung zu einer anderen Faser des
Zielfragments. Die Zündkapseln werden in Position
gebracht, damit, wenn jedes durch die Tätigkeit einer DNA Polymerase
ausgedehnt wird, die eben synthetisierten Fasern die verbindliche Site
des gegenüberliegenden Oligonucleotide sich überlappen. Während der Prozeß von Denaturierung, von Ausglühen
und von Polymeraseextension fortgesetzt wird, binden die Zündkapseln
wiederholt an die ursprüngliche DNA Schablone und die ergänzenden
Sites in den eben synthetisierten Fasern und werden ausgedehnt, um
neue Exemplare von DNA zu produzieren (Abbildung 3). Das
Ende Resultat ist eine exponentiale Zunahme der Gesamtzahl DNA
Fragmenten, die die Reihenfolgen zwischen den PCR Zündkapseln
einschließen, die schließlich an einem theoretischen Überfluß an
2n dargestellt werden, in dem n die Zahl Schleifen (1.7.13) ist.
Eine DNA Polymerase ist ein natürlich vorkommendes Enzym, ein biologisches
Makromolekül, das die Anordnung und die Reparatur von DNA
katalysiert. Es funktioniert, indem es zu einer einzelnen DNA
Faser bindet und eine ergänzende Faser herstellt. Die
genaue Reproduktion alles lebenden Stoffes hängt von dieser
Aktivität ab, in der sie arbeitet, um DNA zu kopieren, wenn Zellen
sich teilen (10.11). Erst haben Sie vor kurzem
Wissenschaftler erlernt, um diese Aktivität zu manipulieren und sie
an der wissenschaftlichen Forschung anzuwenden. Die
frühesten PCR Experimente utlilized das Klenow Fragment von
Escherichia Coli DNA Polymerase I bei einer Temperatur von 37C, um
spezifische Ziele von menschlicher genomic DNA (5.6) zu verstärken. Häufig produzierten diese PCR Reaktionen unvollständig
reines Zielprodukt, wie durch Gelelektrophorese (1) geurteilt. Diese Ausgangs-PCR Verstärkungen mit dem Klenow
Fragment waren nicht in hohem Grade spezifisch (5.6). Obgleich ein eindeutiges DNA Fragment verstärkte Falte
~200,000 von genomic DNA sein könnte, nur ungefähr 1% des PCR
Produktes die gerichtete Reihenfolge (13) war. Eine
spezifische Hybridationprüfspitze wurde benoetigt, die verstärkte
DNA (5.6) zu analysieren.
Irgendein PCR Zustände wurden festgestellt, um die Strenge der
besser gekleideteren Hybridation wie niedrigere MgCl2konzentrationen
und höhere Ausglühentemperaturen zu erhöhen.
Ausserdem alle macht Konzentration des Enzyms und der
Zündkapseln, die Glühdauer, die Extension Zeit und die Zahl von PCR
wurden gefunden, um die Besonderheit des PCR zu bewirken einen
Kreislauf durch.
Auch die Konzentration einer spezifischen Reihenfolge in einer
Probe kann die relative Homogenität der PCR Produkte (1.7.13.14.15)
auch beeinflussen. Deoxyribonucleotide Triphosphate und
Magnesium in einem passenden Buffer ist auch wichtige Bestandteile
für PCR. Die Leistungsfähigkeit und die Besonderheit
von PCRs können durch Schwankungen der Konzentration und des
Verhältnisses des freien Magnesiums, der deoxyribonucleotide
Triphosphate und der Zündkapseln beeinflußt werden. Diese Reagenzien müssen optimiert werden, um hohe
Besonderheit und Ergebnis (14) zu erzielen. Es wurde
auch daß der Effekt der Temperatur und der
Oligonucleotidezündkapsellänge auf der Besonderheit und der
Leistungsfähigkeit der Verstärkung durch die
Polymerasekettenreaktion (15) entdeckt.
Die Inaktivierung des Klenow Fragments von Escherichia
Coli DNA Polymerase I an der Hochtemperatur, die für Fasertrennung
benötigt wurde, benötigte die Hinzufügung des Enzyms nach dem
Denaturierungjobstep jeder Schleife (5.6). Vor 1988
wurde jedermann, das eine PCR Reaktion Prozedur leitet, verbunden, um
geduldig zu sitzen durch eine Reihe Wasserbäder oder erhitzenblöcke
und eine frische Aliquote der E.Coli DNA Polymerase nach jedem Denaturierungjobstep
hinzuzufügen, der gewöhnlich durchgeführt wurde, indem man den
Reaktion Behälter in kochendem Wasser für ½ untertauchte;
eine Minute zu 3 Minuten (7). Dieser ziemlich
langwierige Jobstep wurde durch die Einleitung einer hitzebeständigen
DNA Polymerase, die Taq DNA Polymerase (12) einmal, am Anfang der PCR Reaktion
beseitigt. Die hitzebeständigen Eigenschaften der DNA
Polymeraseaktivität wurden vom Thermus aquaticus (Taq) lokalisiert
(Abbildung 4), die in den Geysiren von Über110C wachsen und haben
groß zum Ergebnis, zur Besonderheit, zur Automatisierung und zum
Hilfsprogramm der Polymerasekettenreaktion (1.7.12) beigetragen. Das Taq Enzym
kann widerstehen wiederholte Heizung zu 94C und also beträgt jede
Zeit, welche die Mischung abgekühlt wird, um die
Oligonucleotidezündkapseln den Katalysator für die Extension binden
zu lassen, bereits anwesend (1.7). Jedoch wurden höhere
Ausglühentemperaturen nicht bis die einzelne “wichtigste
Entwicklung von PCR Entwicklung (8)” , von Reinigung und
von kommerzieller Verteilung einer hitzebeständigen DNA Polymerase
vom thermophilen Bakterium Thermus aquaticus ( Taq)hergestellt (12).
Die Lokalisierung einer hitzebeständigen DNA Polymerase
erlaubte auch besser gekleideteres Ausglühen und die bei den
erhöhten Temperaturen (1.7.12.13) durchgeführt zu werden Extension,
falsch anpaßte, dadurch sich esverringert esverringert, Ausglühen zu
den nontarget Reihenfolgen (unspezifische Verstärkung) oder zu
zunehmender Besonderheit. Auf diese Art denn viele
Verstärkungen könnte das PCR Produkt als einzelnes Äthidium
Bromid-beflecktes Band auf einem elektrophoretischen Gel (12) entdeckt
werden. Diese erhöhte Besonderheit erhöhte auch DNA
Ergebnis der Zielreihenfolge. Außerdem konnten längere
PCR Produkte von genomic DNA verstärkt werden, vermutlich wegen einer
Verringerung der Sekundärstruktur der Schablone Fasern bei der
erhöhten Temperatur, die für besser gekleidetere Extension verwendet
wurde. Die obere Größe Begrenzung für Klenow
Fragment-Polymeraseverstärkung war nur über 400bp. Taq
Polymerase und andere hitzebeständige Polymerasen haben Fragmente bis
10 KBS (1.7.12.13) synthetisiert. Die Verwendbarkeit der Taq Polymerase hat auch
groß die Automatisierung der Reaktion vereinfacht, da es eine viel
einfachere Aufgabe ist, einen Apparat zu konstruieren, der ein
Reaktion Gefäß durch unterschiedliche Temperaturen als, eine Einheit
herzustellen einen Kreislauf durchmacht, die das Thermocycling und die
Hinzufügung der Enzymaliquoten durchführen würde. Aktuell gibt es eine große Vielzahl der thermocyclers,
die kommerziell vorhanden sind. Diese Entwicklung ist
ein bedeutender Faktor in der schnellen Anwendung dieser Technologie
durch die wissenschaftliche Gemeinschaft (7) gewesen.
Zusätzlich zur Produktion der double-stranded,
stumpf-beendeten DNA Fragmente, die von PCR gebildet werden können,
scheme zwei andere Merkmale des PCR beitragen groß zum Hilfsprogramm
von PCR. Zuerst definiert die Position der
Schwergängigkeit der Zündkapseln die Grenzen des verstärkten
Fragments und folglich wird die vorherige molekulare Klonenanforderung
der Beschränkung Endonuclease-Anerkennung Sites nicht für PCR
benoetigt. Da nur eine begrenzte Anzahl von DNA
Reihenfolgen Beschränkung Sites sind, erhöht PCR groß die
Flexibilität der Wahl der Fragmentgröße und -aufbaus. Zweitens ist es nicht notwendig für PCR
Oligonucleotides, zur Schablone DNA ergänzend genau zu sein. “Endstücke” können dem Ende 5’ der Zündkapsel hinzugefügt werden, um Reihenfolgen
innerhalb der Schiess-Zündsatz Sites vorzustellen, die folglich
ausgenutzt werden können, um Beschränkung Endonuclease-Anerkennung
Sites oder andere nützliche Reihenfolgen wie Veränderungen in die
verstärkte DNA vorzustellen. Dieses erlaubten
Phänomene das Hervortreten von PCR als Methode für schnelles DNA
Klonen (1.7.13).
Molekulares Klonen hat vom Hervortreten von PCR
als Technik profitiert. Direktes Klonen wurde zuerst mit
einem 110 BP DNA Fragment geleitet, das von PCR verstärkt wurde und
Oligonucleotidezündkapseln, die Beschränkung
Endonuclease-Anerkennung Sites enthielten, fügten ihren 5’ Enden hinzu. Diese Sites wurden benutzt,
um Klonen der verstärkten DNA in ein Plasmid M13 (17) zu erleichtern. Das 110 BP Fragment wurde auch sequentiell geordnet, um
zu bestätigen, daß diese Annäherung eine schnelle dennoch
zuverlässige Annäherung zum Klonen war. (Abbildung 5)
Auf ZellenbasiscDna Klonen bezieht DNA
Reproduktion in vivo mit ein, die auf eine sehr Highfidelity der Kopie wegen des
Korrekturlesens der Einheiten bezieht. Jedoch wenn DNA
in vitro wie mit PCR wiederholt wird, ist die kopierenfehlerhäufigkeit
beträchtlich grösser. Die allgemein verwendete
Polymerase, Taq DNA Polymerase
jedoch, hat kein verbundenes exonuclease’3 bis’ 5, zum zu konferieren eine lesenfunktion. So ist die Fehlerhäufigkeit wegen des niedrigen
misincorporation während der DNA Reproduktion für Taq
ziemlich hoch: für
ein 1 KB ordnen Sie, das 20 wirkungsvolle Schleifen Verdopplung
durchgemacht hat, ungefähr 40% der neuen DNA Fasern synthetisiert von
PCR sequentiell, der dieses Enzym verwendet, enthält ein falsches
Nukleotid, resultierend aus einem kopierenfehler (16). Folglich glätten Sie, wenn die PCR Reaktion
Verstärkung einer einzelnen DNA Reihenfolge miteinbezieht, das
abschließende Produkt ist eine Mischung von fast zusammenpassen, aber
nicht identische DNA Reihenfolgen. Trotz der Fehler
wegen der Reproduktion in vitro, DNA kann das Sequentiell ordnen des Gesamt-PCR Produktes
die korrekte Reihenfolge wegen der Tatsache geben, daß die
Gesellschaftsgründung der falschen Unterseiten im Wesentlichen
gelegentlich ist und der Beitrag von einer falschen Unterseite auf
einer oder mehr Fasern durch die Beiträge von der sehr großen
Mehrheit einen Fasern überwältigt wird, die die korrekte Reihenfolge
haben. Jedoch wenn das PCR Produkt in den Zellen geklont
werden soll, einiges klont Einzelperson kann sequentiell geordnet
werden müssen, um die korrekte (Übereinstimmung) Reihenfolge, vor
weiteren Leitexperimenten festzustellen.
Vor kurzem, ist das Problem Untreue der DNA Reproduktion
während der PCR Reaktion beträchtlich durch das Verwenden der
alternativen hitzebeständigen DNA Polymerasen verringert worden, die
exonuclease 3 bis’ 5 Aktivität’ verbunden
haben. Pyrococcus furiosus (Pfu) DNA
Polymerasen und Thermococcus Litoralis (ENTLÜFTUNGSÖFFNUNG) werden verwendeten allgemein wegen
des Korrekturlesens, das durch ihr verbundenes exonuclease 3’ bis 5’ Aktivität (18) konferiert wird. Das resultierende PCR Produkt von Pfu zum Beispiel, hat
eine viel unterere Stufe der Veränderungen, die durch die Kopie von
von Fehlern eingeführt werden: für ein 1 KB Segment von DNA,
die 20 wirkungsvolle Schleifen Verdopplung durchgemacht hat, ungefähr
schwemmt 3.5% der DNA im Produkt tragen eine geänderte Unterseite an
(16).
Die neuen Annäherungen, zum von von Besonderheit
zu verbessern sind gründeten auf der Anerkennung entwickelt worden,
daß die Taq DNA Polymerase beträchtliche enzymatische Aktivität bei
den Temperaturen gut unterhalb des Bestwertes für DNA Synthese
beibehält. So können die Zündkapseln, die
non-specifically zu einer teilweise einzelnen angeschwemmten Schablone
Region tempern, ausgedehnt sein, bevor die Reaktion 72°C für
Extension der spezifisch getemperten Zündkapseln erreicht. Wenn die DNA Polymerase aktiviert wird, nur nachdem die
Reaktion hohe (> 70°C) Temperaturen erreicht hat, kann Nichtziel
Verstärkung herabgesetzt werden (19.20). Diese “Heißstart-” Annäherung kann durch
manuelle Hinzufügung eines wesentlichen Reagens zum Auswahlgefäß
bei erhöhten Temperaturen vollendet werden. Die
Hinzufügung ssDNA des verbindlichen Proteins ist auch berichtet
worden, um spezifische Verstärkung zu erhöhen. Eine
benutzerfreundlichere Annäherung soll entweder Hemmung oder
Inaktivierung der DNA Polymerase selbst verwenden. Zwei
Typen Hemmung der Taq DNA Polymerase sind einschließlich
Oligonucleotidehemmung (21) und Hemmung des Antikörpers (22) versucht
worden. In hohem Grade spezifische Oligonucleotidehemmnisse
beider Taq DNA Polymerasen sind produziert worden. Diese
hemmen selektiv DNA Polymeraseaktivität bei den Temperaturen unter
40°C und sind zur Funktion in den Heißstartanwendungen gezeigt
worden. Wechselweise kann man einen Antikörper gegen
Taq DNA Polymerase benutzen. Der Antikörper hemmt die DNA
Polymerase, bis die Temperatur des PCR so ist, daß der Antikörper
bei einer Temperatur denaturiert wird, die als 55°C grösser ist,
dadurch freigibt man das Enzym. Jedoch es gibt Nachteile
zu diesem Typen der Heißstartzustände. In diesem Fall
benötigt man einen Antikörper für jedes unterschiedliche Enzym, das
in einem PCR benutzt wird und für viel PCRs kann dieses erheblich
steigen Kosten. Das bequemste Formular des Heißstarts
soll die DNA Polymerase ändern, so daß sie bei der Raumtemperatur
(Temperatur-empfindliche Durch Mutation entstehende Variation)
unaktiviert ist, und wird nur nach Ausbrütung an 95°C für 6-15
Minuten (23) reaktiviert.
Wegen seiner Einfachheit ist PCR eine populäre
Technik mit einer breiten Benutzungsmöglichkeit
einschließlich das direkte Sequentiell ordnen, genomic
Klonen, schreibende DNA, Abfragung der ansteckenden Mikroorganismen,
Site-verwiesene Mutagenese, prenatale genetische Krankheitforschung
und Analyse der allelic Reihenfolge Varianten (1.7.13.16) die von im
Wesentlichen drei Hauptvorteilen der Methode abhängen:
Geschwindigkeit und Benutzerfreundlichkeit: DNA Klonen durch PCR kann in einer verhältnismäßig
kurzen Zeitmenge, innerhalb einiger Stunden durchgeführt werden. Normalerweise besteht eine PCR Reaktion aus herum 30
Schleifen jede Schleife, die eine Denaturierung, Synthese enthält und
Jobstep reannealing, wenn eine einzelne Schleife gewöhnlich 3 5
Minuten dauert, in einem automatisierten thermischen
cycler. Dieses ist offenbar schneller als die Zeit, die
für auf ZellenbasiscDna Klonen benötigt wird, das Wochen der Zeit
dauern könnte. Ausserdem ist es ziemlich einfach, eine
PCR Reaktion zu installieren und der Gebrauch einer thermocycler
Maschine ist auch einfach. Einige Zeit wird für das
Design und die Synthese der Oligonucleotidezündkapseln benoetigt,
aber dieses ist durch die Verwendbarkeit der Computer-Software für
besser gekleideteres Design und schnelle kommerzielle oder akademische
Synthese der kundenspezifischen Oligonucleotides vereinfacht worden. Optimierung der PCR Zustände kann wie besser
gekleidetere Ausglühentemperatur, Magnesiumkonzentration und besser
gekleidetere Konzentration benötigt werden. Jedoch hat
die Kreation der Maschinen der Steigung PCR, die erlauben, daß eine
Vielzahl der besser gekleideteren Ausglühentemperaturen gleichzeitig
geprüft wird, groß die Zeit verringert, die für diesen Jobstep
benötigt wird. Einmal sind die optimalen Bedingungen
für eine Reaktion, die Reaktion können dann einfach wiederholt
werden erreicht worden (1.7.13.16).
Empfindlichkeit: PCR ist zur
Verstärkung der Reihenfolgen von den minuziösen Mengen Ziel DNA,
sogar die DNA von einer Einzelzelle (24) fähig. Solche
vorzügliche Empfindlichkeit hat sich neue Methoden des Studierens der
molekularen Pathogenese geleistet und hat gefunden zahlreiche
Anwendungen in der gerichtlichen Wissenschaft, in der Diagnose, in der
genetischen Gestängeanalyse mit den schreibenden Einzelnsamenzellen
und in den molekularen Paläontologiestudien, in denen Proben die
minuziösen Anzahlen von Zellen enthalten können. Jedoch
bedeutet die extreme Empfindlichkeit der Methode, daß große Obacht,
um Verschmutzung der Probe in Untersuchung zu vermeiden durch externe
DNA angewendet werden muß, wie von minuziöse Mengen Zellen vom
Bediener (1.7.13.16).
Robustheit: Eine ausgedehnte
Strecke der Nukleinsäurequellen sind verwendbare Schablonen für PCR
Verstärkung. Gereinigtes DNAs von der verschiedenen
Sorte und Quellen sind verstärkt worden. PCR kann
Verstärkung der spezifischen Reihenfolgen vom Material ermöglichen,
in dem die DNA falsch in einem Medium vermindert oder eingebettet
wird, von dem herkömmliche DNA Lokalisierung problematisch ist.
Infolgedessen ist es wieder für molekulare Anthropologie sehr
verwendbar und Paläontologie studiert, z.B. die Analyse von DNA
erholt von archäologischem Remains. Sie ist auch erfolgreich
verwendet worden, um DNA von Formalin-örtlich festgelegtem zu
verstärken, oder Paraffin-eingebettete Gewebeproben, die wichtige
Anwendungen in der molekularen Pathologie und hat, in einigen Fällen
im genetischen Gestänge studiert. Im Allgemeinen ist
der Erfolg der PCR Verstärkung am größten, wenn Zielfragmente
verhältnismäßig reichlich vorhanden sind (1.7.13.16).
Trotz seiner sehr großen Popularität hat PCR
bestimmte Beschränkungen als Methode für spezifische DNA
Reihenfolgen selektiv klonen.
Zwecks spezifische Oligonucleotidezündkapseln zu konstruieren
die vorgewählte Verstärkung einer bestimmten DNA Reihenfolge
ermöglichen, sind etwas vorherige Reihenfolge Informationen
normalerweise notwendig um Dieses bedeutet
normalerweise, daß die DNA Region des Interesses teils vorher
gekennzeichnet worden ist, häufig folgendes vorheriges auf
ZellenbasiscDna Klonen. Jedoch ist eine Vielzahl der
Annäherungen entwickelt worden, die die Notwendigkeit zu der
vorherigen DNA Reihenfolge Information hinsichtlich ist der Ziel DNA
verringern oder sogar ausschließen. Vorher
uncharacterized DNA Reihenfolgen können mit PCR mit degenerierten
Oligonucleotides manchmal geklont werden, wenn sie Bauteile eines Gens
oder sich wiederholende DNA Familie eine mindestens sind von deren
Bauteilen vorher gekennzeichnet worden ist. In einigen
Fällen kann PCR ohne irgendwelche vorherigen Reihenfolge
Informationen hinsichtlich sind der Ziel DNA effektiv verwendet
werden, um indiscriminateamplification der DNA Reihenfolgen von einer
Quelle von DNA zu ermöglichen, die in extemely begrenzten
Quantitäten anwesend ist. Folglich obgleich PCR
angewendet werden kann, um vollständige Genomverstärkung
sicherzustellen, hat es nicht den Vorteil des auf ZellenbasiscDna
Klonens, wenn es eine Methode des Trennens der einzelnen DNA anbietet,
klont das Enthalten einer genomic DNA Bibliothek.
Die Menge des PCR Produktes erhalten in einer einzelnen Reaktion
ist viel auch begrenzt, als die Menge, die mit auf Zellenbasisklonen
erhalten werden kann, in dem von den Datenträgern der Zellkulturen
einstufenSie, möglich ist. Die Leistungsfähigkeit einer PCR
Reaktion schwankt von Schablone zu Schablone und entsprechend
verschiedenen Faktoren, die benoetigt werden, um die Reaktion zu
optimieren, aber gewöhnlich nur verhältnismässig etwas des
Produktes erzielt werden.
Obgleich das theoretische Ergebnis von PCR exponential ist,
zeigt die effektive Rendite eines PCR viel weniger an, daß der
Entwurf mit kleiner als sein maximales Potential funktioniert. Z.B. ebnet die Menge des Produktes an jeder Schleife
schließlich weg. Diese Hochebene kann durch die
folgenden Phänomene erklärt werden. Zuerst können
etwas von der Schablone an den Faserbrüchen oder am Ausfall der DNA
nie zu getrennt von anderen Makromolekülen während der Reinigung und
der Ausgangsthermocycles vorhandenes liegen. Zweitens
ist die Menge des Enzyms begrenzt und schließlich kann Aktivität
sich verringern. Drittens da die Konzentration des
double-stranded Produktes hohe Stufen erreicht, erhöht sich
Konkurrenz zwischen Ausglühen der Schablone (PCR Produkt) auf
Zündkapsel und des Reannealings der ergänzenden Schablone Fasern
(1.7.13).
Ein offensichtlicher und vieler Mal großer Nachteil von PCR als
DNA Klonenmethode ist die Größe Strecke der DNA Reihenfolgen
gewesen, die geklont werden können. Anders als das auf
ZellenbasiscDna Klonen, in dem die Größe der geklonten DNA
Reihenfolgen Mb 2 sich nähern kann, die DNA Reihenfolgen berichtet,
die von PCR geklont werden, sind gewöhnlich in den 0.1 5
KBS Größe Strecke, häufig am untereren Ende dieser
Skala gewesen. Kleine Fragmente von DNA können von PCR
normalerweise leicht verstärkt werden, gleichwohl es in zunehmendem
Maße schwieriger wird, leistungsfähige Verstärkung zu erreichen,
während die gewünschte Produktlänge sich erhöht. Barnes (25) erkannte eine Ziellänge Beschränkung zur
PCR Verstärkung von DNA. Er verwendete eine Kombination
einer hohen Stufe von einem exonuclease-freien, N-Terminal Auslassung
Durch Mutation entstehende Variation der Taq DNA Polymerase, Klentaq1,
mit einer sehr niedrigen Stufe einer hitzebeständigen DNA Polymerase,
die eine Aktivität 3'-exonuclease ausstellt (Pfu,
Entlüftungsöffnung oder tiefe Entlüftungsöffnung) um Highfidelity
PCR lang zu leiten. Mindestens können 35 KBS von
Bakteriophagelambda zu den hohen Ergebnissen von 1 ng der Lambda DNA
Schablone verstärkt werden. Gebrauch von dieser Methode
erbrachte erhöhte Unterseite-Paar Treue, die Fähigkeit, PCR Produkte
als Zündkapseln zu benutzen und das maximale Ergebnis des
Zielfragments. Andere Bedingungen sind für
wirkungsvolle Verstärkung der längeren Ziele, einschließlich
Verstärkung von bis 22 KBS des Beta-globin Genblockes von
menschlicher genomic DNA und von bis 42 KBS von phaga Lambda DNA (26)
gekennzeichnet worden. Die Bedingungen für diese langen
PCRs schlossen erhöhten pH, die Hinzufügung des Glycerins und des
Dimethyl Sulfoxids ein, verringert Denaturierungzeiten, erhöht
Extension Zeiten und benutzen einer hitzebeständigen DNA
zweitenspolymerase, die ein 3'-to 5'-exonuclease besitzt, oder "des
Korrekturlesens," Aktivität. Das "langes PCR" Protokoll
behielt die Besonderheit bei, die für Ziele in genomic DNA benötigt
wurde, indem es unterere Stufen der Polymerase und Temperatur- und
Salzzustände für spezifisches Zündkapselausglühen verwendete. Die Fähigkeit, DNA Reihenfolgen von 10-40 KB zu
verstärken holt die Geschwindigkeit und die Einfachheit von PCR zum
genomic Diagramm und zum Sequentiell ordnen und erleichtert Studien in
den molekularen Genetik (26). Im Allgemeinen beziehen
die Bedingungen für lange Strecke PCR eine Kombination von
Änderungen an den Standardbedingungen in ein Zweipolymerase System
mit ein. Dieses liefert optimale Stufen der DNA
Polymerase- und exonuclease’3 bis’ 5
aktivität, die als leseneinheit (16) dient.
Thermocyclers, die automatisch regeln,
Temperaturen für das PCR Radfahren wurden 1986 eingeführt (Abbildung
6). Zusätzlich zu den Fortschritten in den PCR
Reagenzien, sind neue Instrumente für das automatisiertes einen
Kreislauf durchmachende Thermal und für das Analysieren der PCR
Produkte entwickelt worden. Neue thermische cyclers
haben Kinetik der Heizung erhöht und gekühlt ab und
Wärmeübertragung auf geänderte Reaktion Behälter. Die Reaktion Behälter, die durch die erstes Erzeugung
thermischen cyclers angepaßt wurden (oder sogar die Wasserbäder und
die Heizung Blöcke) waren Standardplastikmicrofuge Gefäße. PCR Verstärkung in den dünnen haarartigen Gefäßen
erlaubte das schnelle thermische Radfahren und DNA Synthese zu 20s. Die Geschwindigkeit der Temperaturwechsel, die in diesen
Systemen erzielt werden, hat die exakte Definition der
Temperaturbestwerte für jeden einzelnen Jobstep in der PCR Schleife
erlaubt. Die neues Erzeugung thermischen cyclers auch
passen mehr Proben an, haben exaktere thermische Profile, und sind
programmierbar (13).
Einer der wenigen geschätzten Beiträge zur
weitverbreiteten Anwendung von PCR ist die Entwicklung der
zuverlässigen automatisierten Chemie für Oligonucleotidesynthese
gewesen. Bis vor kurzem war der Aufbau eines einzelnen
Oligonucleotide eine erhebliche Aufgabe, die von einem erfahrenen
organischen Chemiker nur durchgeführt werden könnte. Jetzt ist es möglich, jedes einen
Oligonucleotidesynthesizer zu kaufen, der durch einen Techniker oder
die Oligonucleotides selbst von einer kommerziellen oder akademischen
Quelle bearbeitet werden kann. Multiplexoligonucleotidesynthesemaschinen sind mit dem
Ziel des Verringerns der gesamten Kosten der Synthese (27.28)
konstruiert worden. Da die Oligonucleotides die etwaigen
PCR Produkte definieren, es besteht kaum Zweifel, daß in Ermangelung
ihres betriebsbereiten Zubehör, PCR nicht die breite Abnahme genossen
haben würde, die es heute gewonnen hat (13).
Die Forscher, die früh über den das Design der
PCR Zündkapseln einig ge$$$WESEN wurden, waren schwierig und
unzuverlässig. Computerprogramme wurden geplant, um
alle Designkriterien in Betracht zu ziehen. Eins der
ersten Programme, die für besser gekleideteres Design geschrieben
wurden, war Olga, das die Implementierung des Digital Forschung
EDELSTEINS (Graphik-Umgebung Manager) auf der Atari Str. (29)
gebrauchte. Olga wurde spezifisch zur
Polymerasekettenreaktion (PCR) simultane Analyse von zwei besser
gekleideteren Reihenfolgen erlaubend entsprochen. Der
Vorteil von Olga war, daß er in den Analysen mit einen Programmen
für direkte Wiederholungen, Sekundärstrukturen und besser
gekleidetere Dimerisation sowie einige nützliche ' Vollenden'
Hilfsmittel für die Arbeiter zur Verfügung stellte, die an PCR
Optimierung und Oligonucleotidesynthesen teilnahmen. Das
Programm Primer3 am Whitehead Institut wird jetzt gedacht, um das
zuverlässigste und vielseitigeste begabt zur Zeit verfügbare
Hilfsmittel zu sein (30).
PCRs kann jetzt durchgeführt werden, die
Verstärkung der DNA Fragmente bis zu einigen kilobases aktivierend in
der Länge bis zum mehr als eine Millionmal ihr Ausgangsüberfluß. Die Prozedur ist in hohem Grade automatable und
benötigt gerade einige Stunden vom Beginn des Thermocylings zur
Produktanalyse. Dieses war nicht der Fall vorher, und
die praktischen Anforderungen für das Durchführen eines PCR sind
groß seit den ersten Manuskripten der Methode (13) vereinfacht
worden. Heute sind die meisten
Ausgangsanhängevorrichtungen oder Unwirtschaftlichkeiten des PCR (8)
ausgearbeitet worden. Ausserdem hat PCR erweitert, um
mehr als 270.000 Artikel (31) einzuschließen.
Polymerasekettenreaktion ist die allgemein verwendete Methode für in-vitro- DNA Verstärkung, jedoch, das sie thermische Denaturierung oder das Thermocycling benötigt, um die zwei DNA Fasern zu trennen. In vivowird DNA durch DNA Polymerasen mit verschiedenen zusätzlichen Proteinen wiederholt. DNA helicase, zusätzliche Proteine einer DNA Polymerase fungiert, um Duplex-DNA innerhalb der Zellen zu trennen. Vincent et al.. (32) haben eine neue in-vitro isothermal- DNA Verstärkung Methode geplant, indem es die in vivo Reproduktion einheit nachahmte. Helicase-abhängige Verstärkung (HDA) verwendet ein DNA helicase, um einzeln-angeschwemmte Schablonen für besser gekleidetere Hybridation festzulegen. Folgende Zündkapselextension wird dann durch eine DNA Polymerase katalysiert. HDA benötigt nicht ein kostspieliges thermocycler und folglich kann PCR praktisch überall durchgeführt werden. Zusätzlich es anbietet einige Vorteile über anderen Isothermal-DNA Verstärkung Methoden indem es einen einfachen Reaktion Entwurf hat und eine zutreffende Isothermalreaktion ist, die bei einer Temperatur für den gesamten Prozeß durchgeführt werden kann. HDA bietet große Versprechung in der Entwicklung der einfachen beweglichen DNA Diagnoseeinheiten an, in auffangene und an der Punkt-von-Obacht (32) verwendet zu werden.
Es wird gesagt, daß die einfachste und bequemste
Methode, PCR zu definieren als Technik ist. Jedoch beseitigt
solch eine Kategorisierung die Geschichte der PCR's Entwicklung bis zu
Einzelpersonen über den Jahren, die zu den Ideen hinter der Theorie
von PCR und der fein-Justage der Technik beigetragen werden. Die folgende einfachste Antwort soll eine Einzelperson
als der Erfinder der Polymerasekettenreaktion benennen. Karry Mullis wurde den Nobelpreis für Chemie 1993 für
seine Entdeckung von PCR zugesprochen. Jedoch wird diese
Entdeckung unter vielen Wissenschaftlern gewetteifert, die zum
Entsperren dieses Puzzlespiels beigetragen haben können.
Es ist auch gesagt worden, daß PCR nicht existierte, bis es
gebildet war, um in einem experimentellen System zu arbeiten. Mit diesem im Verstand, bloß ist der Gedanke eines
Konzeptes nicht genügend; ein Konzept muß in Praxis (33)
erfolgreich gesetzt worden sein.
Obgleich es Zweifel hinsichtlich des entscheidenden Schöpfers
von PCR und Zweifel hinsichtlich der Möglichkeit gibt, daß PCR kann
irgendwie oder einmal ersetzt werden, gibt es wenig Zweifel die
Auswirkung, die PCR über einer kurzen Zeitspanne auf der Studie der
molekularen Biologie und der Lebensdauer erstellt hat.
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