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Recombinant Protein-Ausdruck

Copyright- © Molekulare Station 2006

Wenn Sie ein Gen oder ein Protein des Interesses kennzeichnen möchten, müssen Sie seine Funktion zuerst studieren. In dieser molekularen Ära eine DNA Ihres Gens des Interesses ist zu erhalten nicht schwierig.

Um die DNA als Protein auszudrücken, kann IE ein recombinant Protein, man Funktionsstudien mit dem recombinant gereinigten Protein dann leicht durchführen.

Sobald Sie ein gereinigtes Protein haben, können Sie leiten:

• Protein-Protein Interaktion Experimente
• Enzym-Kinetik
• Funktionsstudien des Proteins
• Strukturelle Studien - einschließlich Proteinkristallisation, Proteinstruktur und NMR.
• Sie können das Protein auch benutzen, um Antikörper für weitere Experimente zu bilden.

Es gibt zwei Haupthydraulikanlagen für den Ausdruck des recombinant Proteins. Sobald Sie Ihre DNA geklont erhalten, müssen Sie entscheiden, wo Sie Ihr Protein verstärken möchten. Dieses ist entweder ein prokaryotic (bakteriell) oder eukaryotic (normalerweise System der Hefe oder der Säugetier- Zelle). In, die Wahl Ihres Systems entscheidet, welchen Vektor Sie klonen müssen Ihre DNA da es unterschiedliche Förderer, die in E.Coli arbeiten und andere gibt, die gut mit Hefe oder Säugetier- Systemen funktionieren.

So, die Proteinausdruck System wird, Sie verwenden?

 Systeme für Protein-Ausdruck

Prokaryotic Protein-Ausdruck Systeme

Prokaryotic haben recombinant Protein-Ausdruck Systeme einige Vorteile. Diese schließen Mühelosigkeit der Kultur und sehr schnelle Zelle Wachstumbedeutung ein, die Sie nicht lang warten müssen, um Protein von den bakteriellen Systemen zu erhalten, sobald Sie Ihre DNA klonen. Ausdruck kann in den bakteriellen Proteinausdruck Systemen mit IPTG leicht verursacht werden. Auch Reinigung ist in den prokaryotic Ausdruck Systemen ziemlich einfach und es gibt eine Fülle kommerzielle Installationssätze, die für recombinant Proteinausdruck vorhanden sind.

Andererseits wenn Sie Ihre Proteine für die Funktions- oder enzymatischen Studien benutzen müssen, sind prokaryotic Systeme ein Problem, während die meisten Proteine in den Einbeziehung Körpern unlöslich werden und sind sehr schwierig, als Funktionsproteine wieder herzustellen. Ausserdem können die meisten, wenn nicht alle Pfosten-post-translational Änderungen nicht durch Bakterium und folglich Ihr Protein des Interesses hinzugefügt werden, möglicherweise nicht funktionell sein. Enzymatische Studien können unfruitful folglich sein.

Eukaryotic Ausdruck Systeme

Eukaryotic Gene sind nicht wirklich “zu Hause” in den prokaryotic Zellen, selbst wenn sie unter der Steuerung der prokaryotic Vektoren ausgedrückt werden.  Ein Grund ist, daß E. Coli Zellen häufig die Proteinprodukte der geklonten eukaryotic Gene als Außenseiter erkennen und sie zerstören.  Anders ist, daß prokaryotes nicht die gleichen Arten der posttranslational Änderung durchführen, die Eukaryotes.  Z.B. wird ein Protein, das gewöhnlich zum Zucker in einer eukaryotic Zelle verbunden würde, als bloßes Protein ausgedrückt, wenn es im Bakterium geklont wird.  Dieses kann eine Aktivität oder’eine Stabilität des Proteins s oder mindestens seine Antwort zu den Antikörpern bewirken.  Ein ernsteres Problem ist, daß das Innere einer bakteriellen Zelle nicht ist, wie förderlich zur korrekten Falte der eukaryotic Proteine als das Innere einer eukaryotic Zelle.  Häufig wird das Resultat unsachgemäß, unaktivierte Produkte der geklonten Gene gefaltet. 

Eukaryotic Systeme für den Ausdruck des Proteins schließen ein:

• Hefe
• Säugetier- Zellen
• baculovirus Zellen (Insekt)

Alle diese Systeme sind große eukaryotic Systeme für den Ausdruck der recombinant Proteine.
Vorteile der eukaryotic Proteinausdruck Systeme schließen die Tatsache ein, daß Sie sehr hohe Stufen des Ausdruckes erhalten können. Die Proteine sind einfach mit speziellen Marken, die in die Vektoren einschließlich seins, enthalten sind Myc und anderen Marken zu reinigen.

Sie können Plasmide sogar kaufen, die Ihr Protein in die Media absondern. Folglich können Sie Ihr, System zu wachsen und die Media zu sammeln halten, ohne Ihre Zellen aufzulösen. Es gibt keine Einbeziehung Körper, zum sich ungefähr zu sorgen und Ihre Proteine haben intakte Pfosten-post-translational Änderungen. Diese sind lebenswichtig, wenn Sie die Funktion der Interaktionen eines Proteins und/oder des Protein-Proteins studieren.

Die Nachteile der eukaryotic Proteinausdruck Systeme schließen die Tatsache ein, daß eukaryotic Zellen langsamer als prokaryotic Zellen wachsen.

Ausdruck Vektoren mit starken Förderern

Die Hauptfunktion eines Ausdruck Vektors ist, das Produkt eines Gens normalerweise zu erbringen, mehr das Produkt das bessere.  Folglich werden Ausdruck Vektoren gewöhnlich mit sehr starken Förderern ausgerüstet; das Grundprinzip ist, daß, mehr mRNA produziert wird, mehr das Proteinprodukt gebildet werden.
Ein solcher starker Förderer ist der trp (Tryptophan operon) Förderer.  Es bildet die Grundlage für einige Ausdruck Vektoren, einschließlich ptrpL1.  Es läßt eine trp promoter/operator Region, von einer verbindlichen Site des Ribosoms folgen und kann direkt als Ausdruck Vektor verwendet werden, indem es ein fremdes Gen in die ClaI Site einsetzt. Wechselweise kann die trp Steuerregion beweglich “gebildet werden,” indem man es mit ClaI und HindIII ausschneidet und es vor einem in einsetzt einem anderen Vektor ausgedrückt zu werden Gen,

Durch Induktion erhältliche Ausdruck Vektoren

Es ist normalerweise vorteilhaft, ein geklontes Gen zu halten represed, bis wir betriebsbereit sind, es auszudrücken.  Ein Grund ist, daß die eukaryotic Proteine, die in den großen Quantitäten im Bakterium produziert werden, giftig sein können.  Selbst wenn diese Proteine nicht wirklich giftig sind, können sie Auch zu den großen Stufen aufbauen, daß sie bakterielles Wachstum behinderen.  In jedem Fall wenn das geklonte Gen ständig eingeschaltet wurden bleiben gelassen, würde das Bakterium, welches das Gen trägt, nie zu sich eine große genug Konzentration entwickeln, um aussagefähige Quantitäten des Proteinproduktes zu produzieren.  Die Lösung soll das geklonte Gen halten abgestellt, indem sie es hinter einem durch Induktion erhältlichen Förderer plaziert, der abgestellt werden kann.
Der Gummilackförderer ist bis zu einem gewissen Grad durch Induktion erhältlich, vermutlich restlich aus, bis angeregt durch das synthetische Veranlasser isopropylthiogalactoside (IPTG).  Jedoch ist die Unterdrückung, die durch den Gummilackhemmer verursacht wird, unvollständig, und irgendein Ausdruck des geklonten Gens wird sogar in Ermangelung des Veranlassers beobachtet.  One-way um dieses Problem soll unser Gen in einem Plasmid oder in einem phagemid ausdrücken, das sein eigenes lacI Gen trägt, wie pBS.  Der überschüssige Hemmer, der durch solch einen Vektor produziert wird, hält unser geklontes Gen abgestellt, bis wir betriebsbereit sind, es mit IPTG zu verursachen.
Eine andere Strategie ist, einen fest gesteuerten Förderer als der Bakteriophagen λ förderer PL zu verwenden. Ausdruck Vektoren mit diesem promoter/operator System werden in die Wirtszellen geklont, die ein Temperatur-empfindliches Hemmer λ gen (c1857) tragen.  So lang, wie wir die Temperatur dieser Zellen verhältnismäßig niedrig halten (32°C), arbeitet der Hemmer, und kein Ausdruck findet statt.  Jedoch wenn wir die Temperatur zur nonpermissive Stufe aufwerfen (42ºC), der Temperatur-empfindliche Hemmer können nicht mehr arbeiten und das geklonte Gen wird verursacht.

Ausdruck Vektoren, die Schmelzverfahren Proteine produzieren

Wenn die meisten Ausdruck Vektoren funktionieren, produzieren sie Schmelzverfahren Proteine.  Dieser konnte zuerst ein Nachteil scheinen, weil das Naturprodukt des eingesetzten Gens nicht gebildet wird.  Jedoch können die Extraaminosäuren auf dem Schmelzverfahren Protein eine große Hilfe im Reinigen des Proteinproduktes sein.

Betrachten Sie die Oligohistidin Ausdruck Vektoren, von denen einer die Handelsname pTrcHis hat.  Diese haben eine kurze Reihenfolge gerade stromaufwärts von der mehrfachen Klonensite, die eine Ausdehnung von sechs Histidin verschlüsselt.  So ist ein Protein, das in solch einem Vektor ausgedrückt wird, ein Schmelzverfahren Protein mit sechs Histidin an seinem Aminoende.  Warum würden wir sechs Histidin zu unserem Protein anbringen wollen?  Oligo-Histidin Regionen so haben eine hohe Affinität für Metalle wie Nickel, also können wir Proteine reinigen, die solche Regionen mit Nickelaffinität Chromatographie haben.  Die Schönheit dieser Methode ist seine Einfachheit und Geschwindigkeit.  Nachdem das Bakterium das Schmelzverfahren Protein gebildet hat, lösen wir sie einfach auf, fügen den srude bakteriellen Extrakt einer Nickelaffinität Spalte hinzu, waschen heraus alle ungebundenen Proteine, dann geben das Schmelzverfahren Protein mit Histidin oder einem analogen benannten Imidazol des Histidins frei.  Diese Prozedur erlaubt uns, reines Schmelzverfahren in nur einem Jobstep im Wesentlichen zu ernten.  Dieses ist möglich, weil sehr wenig, wenn irgendwelche natürlichen Proteine Oligohistidin Regionen haben, also unser Schmelzverfahren Protein im Wesentlichen das einzige ist, das an die Spalte bindet.

Was, wenn wir unser proteinfreies der Oligohistidin Marke wünschen? 

Die Entwerfer dieser Vektoren haben durchdacht eine Methode zur Verfügung gestellt, sie zu löschen.  Kurz vor der mehrfachen Klonensite gibt es eine Kodierungregion für eine Ausdehnung der Aminosäuren, die durch das proteolytische Enzym enterokinase erkannt werden.  So können wir enterokinase verwenden, um das Schmelzverfahren Protein in zwei Teile zu zerspalten:  die Oligohistidin Marke und das Protein, die wir wünschen. Die Site, die durch enterokinase erkannt wird, ist sehr selten, und die Wahrscheinlichkeit, daß sie in unserem Protein existiert, ist bedeutungslos.  So sollte unser Protein nicht herauf gehackt werden, während wir seine Oligohistidin Marke löschen.  Wenn wir wünschen, können wir das enterokinase-zerspaltete Protein durch die Nickelspalte noch einmal laufen lassen, um die oligo-hisitidine Fragmente vom Protein des Interesses zu trennen.

λ Bakterien haben auch als die Grundlage für Ausdruck Vektoren gedient;  eins, das spezifisch zu diesem Zweck bestimmt ist, ist λgt11.  Dieses Bakterium enthält eine Gummilacksteuerregion, die vom lacZ Gen gefolgt wird.  Die Klonensites befinden sich im lacZ Gen, also sind Produkte eines Gens, das in diesen Vektor eingesetzt wird, Schmelzverfahren Proteine mit einem Führer der B-Galaktosidase.
Der Ausdruck Vektor λgt11 ist ein populärer Träger für das Bilden und die Rasterung der DNA Bibliotheken geworden.  λgt11 erlaubt uns, eine Gruppe von zu rastern klont direkt für den Ausdruck des rechten Proteins.  Die Hauptbestandteile, die für diese Prozedur benötigt werden, sind DNA Bibliothek in λgt11 und ein Antiserum, das gegen das Protein des Interesses verwiesen wird.
Wir überziehen unsere λ Bakterien mit verschiedenen DNA Einsätzen und beflecken die Proteine, die durch jeden Klon auf einen Support wie Nitrozellulose freigegeben werden.  Sobald wir die Proteine von jeder Plakette auf Nitrozellulose übertragen haben, prüfen wir mit unserem Antiserum.  Zunächst suchen wir nach dem Antikörper, der zum Protein von einer bestimmten Plakette mit beschriftetem Protein A vom Staphylococcus aureus gesprungen wird.  Dieses Protein bindet fest an Antikörper und beschriftet den entsprechenden Punkt auf der Nitrozellulose.  Wir entdecken diesen Kennsatz durch Autoradiographie oder indem wir, dann phosphorimaging, gehen zu unserer Vorlagenplatte und wählen die entsprechende Plakette aus.  Beachten Sie daß wir entdecken ein Schmelzverfahren Protein, nicht das Protein vom Interesse selbst.  Ausserdem macht es nicht aus, wenn wir eine vollständige DNA oder nicht geklont haben.  Unser Antiserum ist eine Mischung der Antikörper, die mit einigen unterschiedlichen Teilen unseres Proteins reagieren, so sogar ein teilweises Gen tut, so lang, wie seine Kodierungregion im gleichen Lagebestimmung und Lesefeld wie die B-Galaktosidase Kodierungregion geklont wird.

Für eine schnelle recombinant Proteinausdruck Zusammenfassung sehen Sie:

Recombinant Protein-Systeme

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