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Membrane Hybridation, zum einer Bibliothek zu rastern

Siebung-Bibliotheken mit Membrane Hybridation

Unter den Bedingungen der Temperatur und der Ionenkonzentration, die in den Zellen gefunden werden, wird DNA in einer Duplex (zwei-angeschwemmten) Struktur durch die Wasserstoffbindungen beibehalten, daß Formular die A und T Unterseiten und G und C die Unterseiten in jeder Faser betwen. DNA Duplices können in einzelne Fasern denaturiert werden, indem man sie, normalerweise in einer verdünnten Salzlösung (z.B., 0.01 M NaCl) erhitzt oder indem man den pH über 11 aufwirft. Wenn die Temperatur gesenkt wird und die Ionenkonzentration in der Lösung wird angehoben oder, wenn der pH zur niedrigen Paarverbesserung der Neutralität gesenkt wird, AN und der GASCHROMATOGRAPHIE zwischen ergänzenden einzelnen Fasern.

Dieser Prozeß geht durch viele Namen: renaturation, Wiedervereinigung, Hybridation, tempernd. In einer Mischung der Nukleinsäuren, nur ergänzende einzelne Fasern (oder die Fasern, die ergänzende Regionen enthalten) ordnen wieder zu; der Umfang einer ihrer Wiedervereinigung ist durch das Vorhandensein der noncomplementary Fasern praktisch unberührt. Solche molekulare Hybridation kann zwischen zwei ergänzenden Fasern entweder DNA oder RNS oder zwischen einer RNS-Faser und einer DNA Faser stattfinden. Molekulare Hybridation in der Abfragung spezifischer DNA zu verwenden klont, einzelne angeschwemmte DNA von den recombinant DNA Molekülen wird angebracht zu einem festen Support, geläufig ein Nitrozellulosefilter oder eine behandelte Nylonmembrane. Wenn eine Lösung, die single0stranded Nukleinsäuren enthält, auf solch einer Membrane getrocknet wird, werden die einzelnen Fasern irreversibel in gewissem Sinne zum festen Support gesprungen, der Blätter die meisten Unterseiten vorhanden für Hybridation für eine ergänzende Faser. Obgleich die Chemie, wenn diese irreversible Schwergängigkeit nicht wohles verstanden ist, die Prozedur sehr nützlich ist. Die Membrane wird dann in einer Lösung ausgebrütet, die radioaktiv beschriftete einzeln-angeschwemmte DNA enthält (oder RNS) die zu etwas von der Nukleinsäure ergänzend ist, die zur Membrane gesprungen wird.

Unter Hybridationbedingungen (nahe NullpH, 40-65 C, 0.3-0.6 M NaCl), hybridisiert diese beschriftete Prüfspitze zur ergänzenden Nukleinsäure, die zur Membrane gesprungen wird. Jede überschüssige Prüfspitze, die nicht hybridisiert, wird weg und die beschrifteten Mischlinge werden entdeckt durch Autoradiographie des Filters gewaschen. Die recombinant lamda virions, die in den Plaketten eines Rasens von E. Coli vorhanden sind, werden auf eine Nylonmembrane durch das Plazieren der Membrane auf die Oberfläche der Petrischale übertragen. Viele der Virenpartikel in jeder Plakette saugen zur Oberfläche der Membrane auf, aber viele virions bleiben in den Plaketten auf der Oberfläche des Nährnährbodens in der Petrischale, die viel einzelnes lamda enthält, klont wird reproduziert auf der Oberfläche der Membrane.

Die Vorlage Petrischale wird gekühlt, um die Ansammlung von lamda zu speichern klont. Die Membrane wird dann in einer alkalischen Lösung ausgebrütet, die die virions stört und die eingekapselte DNA freigibt und denaturiert. Die Membrane wird dann getrocknet und repariert die recombinant lamda DNA zur Oberfläche der Membrane. Zunächst wird die Membrane mit einer radioaktiven Prüfspitze unter Hybridationbedingungen ausgebrütet. Unhybridized Prüfspitze wird weg gewaschen, und der Filter wird Autoradiographie unterworfen.

Das appearence eines Punktes auf dem autoradiogram zeigt das Vorhandensein eines recombinant lamda Klons an, der DNA enthält, die der Prüfspitze ergänzend ist. Die Position des Punktes auf dem autoradiogram entspricht der Position auf der ursprünglichen Petrischale, in der dieser bestimmte Klon eine Plakette bildete. Da die ursprüngliche Petrischale noch viele infectioua virions in jeder Plakette enthält, können Virenpartikel vom gekennzeichneten Klon für das Ersetzen wieder hergestellt werden, indem man das autoradiogram und die Petrischale ausrichtet und Virenpartikel vom Klon löscht, der dem Punkt entspricht. Eine ähnliche Technik kann angewendet werden für die Rasterung einer Plasmidbibliothek in den E.coli Zellen.