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Maxam Gilbert Sequentiell ordnen

Wie DNA sequentiell geordnet wird

DNA, die mit der Maxam-Gilbert Methode sequentiell ordnet

Maxam-Gilbert, das mit dieser Methode von DNA sequentiell ordnend sequentiell ordnet, anstatt, DNA in vitro zu synthetisieren und die Synthesereaktionen mit Ketten-Abschlußwiderständen zu stoppen, diese Methode, beginnt mit in voller Länge, Ende beschrifteter DNA und zerspaltet sie mit niedrigen spezifischen Reagenzien. So, wie diese Methode mit Guaninunterseiten arbeitet, aber die gleiche Grundregel trifft auf alle vier Unterseiten zu; Zuerst Ende-beschriften wir ein DNA Fragment, das wir sequentiell ordnen möchten.

Dieses kann 5 -’oder 3 sein’- beenden das Beschriften. Zunächst ändern wir eine Art Unterseite. Hier benutzen wir Dimethyl Sulfat (DMS) um Guanine zu methylieren. (wirklich, methyliert dieses Reagens auch adenines, aber nicht in einer Methode führt das zu DNA Faserspaltung.) Wie in der Kettenendpunktmethode, möchten wir nicht jedes Guanin beeinflussen, oder wir produzieren nur kleine Fragmente, die uns nicht erlauben, die DNA s’Reihenfolge festzustellen. Folglich tun wir die Methylierung unter milden Bedingungen, die zu einen Durchschnitt von nur einem methylierten Guanin pro DNA Faser führen. Zunächst benutzen wir ein Reagens (Piperidin) das zwei Sachen tut: es verursacht Verlust der methylierten Unterseite, dann es bricht das DNA Rückgrat an der Site der verlorenen Unterseite (die apurinic Site). In diesem Fall wurde der G mitten in der Reihenfolge methyliert, also trat Faserbrechen dort auf und produzierte ein beschriftetes Trimer.

In einem anderen DNA Molekül könnte der erste G nicht methyliert werden und ein beschriftetes Phosphat verursachen (die Unterseite und der Zucker würden in den chemischen Spaltungen verloren). Schließlich entdecken wir electrophorese die Produkte und sie durch Autoradiographie, gerade wie in der Kette-Endpunkt Methode. Selbstverständlich müssen wir drei andere Reaktionen laufen lassen, die an den anderen drei Unterseiten zerspalten. Es gibt einige Methoden des Tuns dies. Z.B. können wir die Glykosidbindungen zum Adenin und zum Guanin mit Säure schwächen; dann verursacht Piperidin depurination und Faserbrechen nach beiden wie und Gs. Wenn wir electrophorese dieses A + G Reaktion neben der G nur Reaktion, wir wie durch Vergleich erreichen können. Ähnlich öffnet Hydrazin thymine und Cytosinringe, und Piperidin kann diese Unterseiten dann löschen und die DNA Faser an den resultierenden apyrumidine Sites brechen. In Anwesenheit 1M NaCl ist Hydrazin für nur Cytosin spezifisch, also können wir diese Reaktion nahe bei der C+T Reaktion laufen lassen und die Ts durch Vergleich erreichen.

Copyright-Molekulare Station 2006