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Massenspektrometrie

Was ist ein Massenspektrometer?

Ein Massenspektrometer basiert auf der einfachen Tatsache, dass verschiedene Chemikalien verschiedene Massen haben, und dieses ist, was feststellt, welche Chemikalien in einer Probe anwesend sind. Es gibt viele Typen Massenspektrometer, die nicht nur die Ionen anders als analysieren, aber produziert verschiedene Typen der Ionen; jedoch alle verwenden sie elektrisch und Magnetfelder, um den Pfad der Ionen auf gewisse Weise zu ändern.

Während des Endes der 80en Jahre und des Anfangs der 90er veranlaßten zwei neue Methoden der Beispielionisierung Massenspektrometrie, eine Umdrehung in der Biopolymeranalyse, nämlich ESI 38 durchzumachen und MALDI.39 gerade einer Dekade vor zum ersten Mal spektrometrische Techniken in der Masse, die die molekularen Massen der femtomole Quantitäten Proteine über kDa 100 messen konnten, als 0.01% Genauigkeit häufig zu verbessern, wurde weit - für Proteinchemiker vorhanden. Diese Methoden sind beides erfolgreiches, wenn sie Ionen von den großen, labilen Biomolekülen ohne bedeutende Verminderung des Parameters bilden. Sind nicht nur sie beide empfindlichen Techniken aber auch schnell - können Mitgliedstaat-und MS/MS Reihenfolgenspektren innerhalb der Sekunden erworben werden. ESI und MALDI, wegen ihrer vielen Unterschiede, ergänzen sich und viele Biopolymerlabors haben Zugriff zu beiden Techniken.

Beispielvorbereitung: 2-Dimensional Elektrophorese und Massenspektrometrie

Beispieltrennung, -lokalisierung und -vorbereitung für die spektrometrischen Massentechniken im Allgemeinen, bezieht 2-DE (2-Dimenisional Elektrophorese), eine Technik mit ein, die bis zu 5000 verschiedene Proteine in einem einzelnen Experiment trennen kann. Im Allgemeinen ist 2-DE zum Trennen der Proteine innerhalb eines isoelektrischen Bereiches des Punktes (PU) 3.5-10 und der molekularen Massen fähig, die von 6 bis kDa 300 reichen, sowie in der Lage seiend, zwischen Pfosten-Übersetzungs- geänderten Proteinen (z.B. phosphoryliert) und ihren nicht-geänderten Begleitern zu unterscheiden. Sobald getrennt, werden die Proteinbestandteile durch Färbtechniken (z.B. silberner Fleck, Leuchtstofffleck, Coomassie Blau) aufgedeckt und einmal gefunden können sie vom Gel dann extrahiert werden. Proteine können nicht von den Gelen ohne den Gebrauch der Reinigungsmittel leicht eluiert werden, die zur spektrometrischen Massenanalyse schädlich sind; zusätzlich neigen große Proteine, heterogen zu sein (z.B. resultierend aus glycosylation) und also besitzen keine molekulare Masse, die mit dem entsprechenden Eintrag in eine Datenbank zusammenhängen kann. Um diese Hindernisse zu überwinden, neigt der Eluierungjobstep vollendet zu werden nachdem das Protein durch eine wässrige Acetonitrilwäsche eines besteuerten Gelstückes verdaut worden ist. Dieses erhöht den Ertrag von Extraktion 5 und indem es eine Ingel Verdauungmethode anwendet, die Trypsin einsetzt, das beschrieben worden ist und am meisten benutzt ist, wie veröffentlicht oder mit geringen Änderungen, produziert eine Frau-kompatible Probe, von der ein Proteinkennzeichen gebildet werden kann. Der Verdauungjobstep kann von einem wahlweise freigestellten Verkleinerungs- und Alkylierungsjobstep vorausgegangen werden, um Disulfidbrücken zu zerspalten und zu blocken, die zwischen Cysteinrückständen existieren. Robotersysteme sind entwickelt worden, um die Ausrottung der Proteinpunkte vom 2D-gel zu automatisieren, um die folgende enzymatische Verdauung durchzuführen und die Proben auf MALDI-MS zu übertragen zielen Sie Platten für die Anfangs-Mitgliedstaat-Analyse. Für viele Anwendungen benötigen die Peptide, die von Ingel Verdauung erholt werden, Konzentration und Reinigung, bevor sie durch Massenspektrometrie analysiert werden, besonders wenn ESI die angewendete Ionisierungmethode ist. Gegenphasische Hochleistungs-Flüssigkeit
Chromatographie (HPLC) ist eine Methode des Erzielens dieses; eine andere Methode bezieht den Gebrauch von ZipTips (Nesselkoralle) (die Pipettespitzen gepackt mit Material C18) oder Poros R2 Übergießen Material mit ein (Perseptive Biosysteme). Trotz seiner weit verbreiteten Abnahme umfassen die Beschränkungen von 2-DE den Ausschluss der sehr kleinen oder sehr großen Proteine, der sehr säurehaltig oder sehr grundlegenden Proteine, sowie hydrophobe Proteine wie Membranenproteine. Es wird dem gedacht
nur 20% der Gel-einprogrammiert Proteine kann sichtbar gemacht werden und analysiert werden. Andere Begrenzungen sind, dass die Menge der Probe, die geladen werden kann, begrenzt ist, die Nichtbeachtung von verursachend
niedrige Konzentrationsproteine und auch das die allgemein verwendetsten Färbtechniken haben nicht lineare Wartefaktoren. In der Praxis ist 2-DE ein arbeitsintensiver Prozess, der Jobstepps manuellen Handhabens mit einbezieht, die die Gelegenheit für Verunreinigungen wie Keratin anbieten, die Proben zu verschmutzen. Ein 2-D Gel nimmt einen Tag, um und ungefähr einen Monat für eine komplette strukturelle Analyse durch Mitgliedstaat abzuschließen, obgleich Automatisierung dem Verschmutzungsproblem helfen und die Analyse gewissermassen beschleunigen kann.


Alternative Proteintrennungtechniken

Alternative, Frau-kompatible Methoden der Proteinvorbereitung sind in Entwicklung, aber keine Technologie ist als Universalwiedereinbau aufgetaucht. Diese Methoden zielen im Allgemeinen darauf ab, die Proteinprobe direkt zu den MS/MS Analysen anzuschließen, die dadurch Zeit raubende Beispielvorbereitungsjobsteps und die Notwendigkeit an einer einleitenden Mitgliedstaat-Analyse beseitigen. Die haarartige isoelektrische Scharfeinstellung (CIEF) - Mitgliedstaat und die vorbereitende isoelektrische Scharfeinstellung, die von Größenausschlußchromatographie-ms gefolgt wird, sind Methoden, die mit 2-DE in Trennung effciency, der Höchstkapazität, Präzision und Robustheit ausgedrückt verglichenes eingehendes gewesen sind, mit dem ehemalig Erscheinen die vorteilhaftere Alternative. Die direkte Analyse der komplizierten Peptidmischungen von einer Mischung der Proteine unter Verwendung der flüssigen Chromatographie des Online-, gegenphasischen Hochleistungs- (HPLC) - MS/MS ist erfolgreich verwendet worden, während eine Alternative zu 2DE und zu diesem auf mehrdimensionale Chromatographie geführt hat, wenn größere Peptidtrennung vor den MS/MS Analysen wünschenswert ist. Beispiele der zweidimensionalen Chromatographie umfassen den Anionen- oder Kationenaustausch, der von der gegenphasischen HPLC- und Größenausschlußchromatographie gefolgt wird, die vom gegenphasischen HPLC gefolgt wird. Anders, alternativer Ansatz ist, die kombinierte festphasige Mikro-extraktion zusammen mit haarartiger Elektrophorese (CER) verbunden zu ESI MS/MS für die Analyse einer Trypsin- Auswahl des Gesamtproteins zu benutzen gewesen. Diese Methode leistete sich hohe Auflösungtrennung der Peptidfragmente, das Kennzeichen von 80-90% der Proteine in diesem bestimmten Heferibosomkomplex erlaubend. Microfluidic Einheiten zu Mitgliedstaat zu verbinden ist eine weitere Strategie, die die handhabende Probe und Trennung kombiniert, sowie an Analyse Nano-ESIMITGLIEDSTAAT ordentlich anschließen. Eine andere Annäherung für vorgewählte Proteinfraktionierung und -kennzeichen setzt ProteinChip Technologie ein (Ciphergen) die eine Oberflächensicherungsmethode unter Verwendung der Antikörper oder der chemisch geänderten Oberflächen einsetzt, um spezifische Kategorien der Proteine zu erfassen, die dann durch MALDI-MS analysiert werden. Diese Technik, bekannt als Oberfläche erhöhte Laser-Desorption-Ionisierung (SELDI) - MS35, hat großes Potenzial für den Vergleich des Proteingehalts der verschiedenen Proben.