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Massenspektrometrie

Was ist ein Massenspektrometer?

Ein Massenspektrometer basiert auf der einfachen Tatsache, daß unterschiedliche Chemikalien unterschiedliche Massen haben, und dieses ist, was feststellt, welche Chemikalien in einer Probe anwesend sind. Es gibt viele Typen Massenspektrometer, die nicht nur die Ionen anders als analysieren, aber produziert unterschiedliche Typen der Ionen; jedoch alle verwenden sie elektrisches und magnetisch fängt auf, um den Pfad der Ionen auf gewisse Weise zu ändern.

Über während des späten Jahres und der frühen neunziger Jahre veranließen zwei neue Methoden der Beispielionisierung Massenspektrometrie, eine Umdrehung in der Biopolymeranalyse, nämlich ESI 38 durchzumachen und MALDI.39 gerade einer Dekade vor zum ersten Mal Masse spektrometrische Techniken, die die molekularen Massen der femtomole Quantitäten Proteine über kDa 100 messen konnten, als 0.01% Genauigkeit häufig zu verbessern, wurde weit für Proteinchemiker vorhanden. Diese Methoden sind beides erfolgreiches, wenn sie Ionen von den großen, labilen Biomolekülen ohne bedeutende Verminderung des Parameters bilden. Sind nicht nur sie beide empfindlichen Techniken, aber auch schnelle – MS- und MS-/MSREIHENFOLGE Spektren können innerhalb der Sekunden erworben werden. ESI und MALDI, wegen ihrer vielen Unterschiede, sind ergänzend und viele Biopolymerlabors haben Zugriff zu beiden Techniken.

Beispielvorbereitung: Elektrophorese 2-Dimensional und Massenspektrometrie

Beispieltrennung, -lokalisierung und -vorbereitung für die spektrometrischen Massentechniken im Allgemeinen, bezieht 2-DE (2-Dimenisional Elektrophorese), eine Technik mit ein, die bis zu wie 5000 unterschiedliche Proteine in einem einzelnen Experiment trennen kann. Im allgemeinen ist 2-DE zum Trennen der Proteine innerhalb eines isoelektrischen Bereiches des Punktes (PU) 3.5 10–und der molekularen Massen fähig, die von 6 bis kDa 300 reichen, sowie könnend, zwischen Pfosten-translationally geänderten Proteinen (z.B. phosphoryliert) und ihren nicht-geänderten Begleitern zu unterscheiden. Sobald getrennt, werden die Proteinbestandteile durch Färbtechniken (z.B. silberner Fleck, Leuchtstofffleck, Coomassie Blau) aufgedeckt und einmal gefunden können sie vom Gel dann extrahiert werden. Proteine können nicht von den Gelen ohne den Gebrauch der Reinigungsmittel leicht eluiert werden, die zur spektrometrischen Massenanalyse schädlich sind; zusätzlich neigen große Proteine, heterogen zu sein (z.B. resultierend aus glycosylation) und also besitzen keine molekulare Masse, die mit dem entsprechenden Eintrag in einer Datenbank zusammenhängen kann. Um diese Hindernisse zu überwinden, neigt der Eluierungjobstep vollendet zu werden nachdem das Protein durch eine wäßrige Acetonitrilwäsche eines besteuerten Gelstückes verdaut worden ist. Dieses erhöht das Ergebnis von Extraktion 5 und indem es eine Ingel Verdauungmethode verwendet, die Trypsin einsetzt, das beschrieben worden ist und allgemein verwendet wird, wie veröffentlicht oder mit geringen Änderungen, produziert eine Ms-kompatible Probe, von der ein Proteinkennzeichen gebildet werden kann. Der Verdauungjobstep kann von einem wahlweise freigestellten Verkleinerung und Alkylierung Jobstep vorangegangen werden, um Disulfidbrücken zu zerspalten und zu blocken, die zwischen Cysteineüberresten existieren. Robotersysteme sind entwickelt worden, um die Ausrottung der Proteinpunkte vom 2D-gel zu automatisieren, um die folgende enzymatische Verdauung durchzuführen und die Proben auf MALDI-MS zu übertragen zielen Sie Platten für die Ausgangs-MSANALYSE. Für viele Anwendungen benötigen die Peptide, die von Ingel Verdauung erholt werden, Konzentration und Reinigung, bevor sie durch Massenspektrometrie analysiert werden, besonders wenn ESI die verwendete Ionisierungmethode ist. Gegenphasische hohe Leistung Flüssigkeit
Chromatographie (HPLC) ist eine Methode des Erzielens dieses; eine andere Methode bezieht den Gebrauch von ZipTips (Nesselkoralle) (die Pipettespitzen gepackt mit Material C18) oder Poros R2 Übergießen Material mit ein (Perseptive Biosysteme). Trotz seiner weitverbreiteten Abnahme schließen die Beschränkungen von 2-DE den Ausschluß der sehr kleinen oder sehr großen Proteine, der sehr säurehaltig oder sehr grundlegenden Proteine, sowie hydrophobe Proteine wie Membrane Proteine ein. Es wird dem gedacht
nur 20% der Gel-einprogrammiert Proteine kann sichtbar gemacht werden und analysiert werden. Andere Begrenzungen sind, daß die Menge der Probe, die geladen werden kann, begrenzt ist, die Nichtbeachtung von verursachend
niedrige Konzentration Proteine und auch das die am geläufigsten verwendeten Färbtechniken haben nicht lineare Wartefaktoren. In der Praxis ist 2-DE ein arbeitsintensiver Prozeß, der Jobsteps manuellen Handhabens mit einbezieht, die die Gelegenheit für Verunreinigungen wie Keratin anbieten, die Proben zu verschmutzen. Ein 2-D Gel dauert einen Tag, um und ungefähr einen Monat für eine komplette strukturelle Analyse durch MS durchzuführen, obgleich Automatisierung dem Verschmutzung Problem helfen und die Analyse gewissermaßen beschleunigen kann.

Alternative Proteintrennungtechniken

Alternative, Ms-kompatible Methoden der Proteinvorbereitung sind unter Entwicklung, aber keine Technologie ist als Universalwiedereinbau aufgetaucht. Diese Methoden zielen im Allgemeinen darauf ab, die Proteinprobe direkt zu den MS/MS Analysen anzuschließen, die dadurch zeitraubende Beispielvorbereitung Jobsteps und die Notwendigkeit an einer einleitenden MSANALYSE beseitigen. Haarartige isoelektrische Scharfeinstellung (CIEF)-MS und vorbereitende isoelektrische Scharfeinstellung, die vom Größe Ausschluß Chromatographie-Ms gefolgt werden, sind Methoden, die mit 2-DE in Trennung effciency, der Höchstkapazität, Präzision und Robustheit ausgedrückt verglichenes eingehendes gewesen sind, mit dem ehemalig Erscheinen das vorteilhaftere alternative.The verweisen Analyse der komplizierten Peptidmischungen von einer Mischung der Proteine mit Online, gegenphasische hohe Leistung flüssige Chromatographie (HPLC)-MS/MS ist erfolgreich verwendet worden, während eine Alternative zu 2DE und zu diesem auf mehrdimensionale Chromatographie geführt hat, wenn grössere Peptidtrennung vor den MS/MS Analysen wünschenswert ist. Beispiele der zweidimensionalen Chromatographie schließen Anion oder den Kationenaustausch ein, der von der gegenphasischen HPLC- und Größenausschluschromatographie gefolgt wird, die vom gegenphasischen HPLC gefolgt wird. Anders, alternative Annäherung ist, kombinierte festphasige Mikro-Extraktion mit der Kapillare electrophoresis(CE) zusammen gewesen zu benutzen, die zu ESI MS/MS für die Analyse einer Trypsin- Auswahl des Gesamtproteins verbunden wird. Diese Methode leistete sich hohe Zerlegungtrennung der Peptidfragmente, das Kennzeichen von 80 90%–der Proteine in diesem bestimmten Heferibosomkomplex erlaubend. Microfluidic Einheiten zum MS zu verbinden ist eine weitere Strategie, die Beispieldas handhaben und -trennung kombiniert, sowie an Nano-ESIMs analysis.A unterschiedliche Annäherung für vorgewählte Proteinfraktionierung ordentlich anschließen und Kennzeichen verwendet ProteinChip Technologie (Ciphergen) die eine Oberflächensicherung Methode mit Antikörpern oder chemisch geänderten Oberflächen, spezifische Kategorien der Proteine zu erfassen einsetzt, die dann von MALDI-MS analysiert werden. Diese Technik, bekannt als Oberfläche erhöhte Laser Desorption-Ionisierung (SELDI)-MS35, hat großes Potential für den Vergleich des Proteingehalts der unterschiedlichen Proben.