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Automatisierte Edman Verminderung

Aminosäure-Reihenfolgen können durch automatisierte Edman Verminderung festgestellt werden

Die Aminosäurestruktur des Peptids wird festgestellt.  Das Peptid wird in seine konstituierende Aminosäure hydrolysiert, indem man sie in 6 N HCl an 110°C 24 Stunden lang erhitzt.  Stanford Moore und William Stein zeigten, daß Aminosäuren in den Hydrolysaten durch ionexchange Chromatographie auf Spalten von getrennt werden können sulfonated Polystyren und quantitativ bestimmt worden, indem man sie mit Ninhydrin reagiert. 

Aminosäuren behandelten dieses Methode Geben eine intensive blaue Farbe, außer Praline, die eine gelbe Farbe gibt, weil sie eine Sekundäraminogruppe enthält.  Die Konzentration der Aminosäure in einer Lösung ist zur optischen Absorption der Lösung nach Heizung es mit Ninhydrin proportional.  Diese Technik kann ein Mikrogramm (10nmol) einer Aminosäure entdecken, die über die Menge ist, die in einem thumbprint vorhanden ist. 

So wenig, wie ein nanogram (pmol 10) einer Aminosäure mittels des fluorescamine entdeckt werden kann, das mit der Einaminogruppe eines in hohem Grade Leuchtstoffproduktes reagiert.  Die Identität der Aminosäure wird durch seinen Eluierungdatenträger aufgedeckt, der im Datenträger des Buffers verwendete, die Aminosäure von der Spalte zu löschen. 

Der Amino-Terminal Überrest eines Proteins oder des Peptids kann gekennzeichnet werden, indem man es mit einem Mittel beschriftet, das ein beständiges kovalentes Link bildet. 

Fluorodinitrobenzene (FDNB) wurde zuerst zu diesem Zweck von Frederick Sanger verwendet.  Dabsyl Chlorverbindung wird jetzt geläufig benutzt, weil sie intensiv farbige Ableitungen bildet, die mit hoher Empfindlichkeit entdeckt werden können.  Sie reagiert mit einer uncharged Gruppe a-NH2, um eine Sulfonamidableitung zu bilden, die unter Bedingungen beständig ist, die Peptidbindungen hydrolysieren. 

Obgleich die dabsyl Methode für die Bestimmung des Amino-Terminal Überrests empfindlich und leistungsfähig ist, kann sie nicht auf dem gleichen Peptid wiederholt verwendet werden, weil das Peptid total im Säure-Hydrolysejobstep vermindert wird.  Pehr Edman plante eine Methode für das Beschriften des Amino-Terminal Überrests und das Zerspalten er vom Peptid, ohne das Peptid zu stören ab, bindet zwischen den anderen Aminosäureüberresten.  Die Edman Verminderung löscht sequentiell einen Überrest auf einmal vom Aminoende eines Peptids.  Phenyl- Isothiozyanat reagiert mit der uncharged Terminalaminogruppe des Peptids, um eine phenylthiocarbamoyl Ableitung zu bilden.  Dann unter mildy säurehaltigen Bedingungen, wird eine zyklische Ableitung der Terminalaminosäure befreit, die ein intaktes Peptid verkürzt durch eine Aminosäure verläßt.

Analysen der Proteinstrukturen sind deutlich durch die Entwicklung von sequenators beschleunigt worden, die automatisierte Instrumente für die Ermittlung der Aminosäurereihenfolge sind.  In einem Flüssigphasensequenator wird ein Dünnfilm des Proteins in einem spinnenden zylinderförmigen Cup der Edman Verminderung unterworfen.  Die Reagenzien und die Extrahierenlösungsmittel werden über den stillgestellten Film des Proteins geführt, und die freigegebene PTHaminosäure wird durch die flüssige Hochdruckchromatographie gekennzeichnet (auch genannt leistungsstarke flüssige Chromatographie, HPLC). 

Eine Schleife der Edman Verminderung wird in weniger als zwei Stunden durchgeführt.  Durch wiederholte Verminderungen kann die Aminosäurereihenfolge von ca. fünfzig Überresten in einem Protein festgestellt werden.  Gasphasensequenators können Picomolequantitäten Peptide und Proteine analysieren.  Diese hohe Empfindlichkeit läßt ihn durchführbar die Reihenfolge einer Proteinprobe analysieren, die von einem einzelnen Band eines SDS-Polyacrylamid Gels eluiert wird.