Ich bin in den EMSA Schmerz!

[Canalba]

Hallo zu allen Wissenschaftlern auf diesem molekularen Biologieforum!

Ich habe ein Problem, das ich hoffe, daß jemand heraus mir mit dort helfen kann! Ich versuche, eine Reihe von EMSAs durchzuführen, um die Schwergängigkeit eines Übertragungfaktors zur Fördererregion meines Zielgens zu kennzeichnen. Ich habe PCR Zündkapseln konzipiert, um ein Produkt von 200-300bp ungefähr zu verstärken, das ich dann extrahiert gelatiere, gereinigt und mit T4-PNK Ende-beschriftet. Ich habe dasselbe zu einer positiven Steuerung (garantiert, um zu arbeiten) und zu a - ve Steuerung getan. Ich habe Protein der ziemlich hohen Konzentration gereinigt, die betriebsbereit ist zu gehen. Bis zu diesem Punkt ist alles gut.

Jetzt, als ich meine Bandschicht durchführe, verschiebt die positive Steuerung und die negative Steuerung nicht, wie erwartet . Mein Testfragment jedoch, zeigt oben als doppeltes Band, wann herausgestellt (gleichmäßig in den Wegen, in denen ich kein Protein - Bedeutung hinzugefügt habe, daß es dort etwas falsch mit diesem DNA Fragment ist). Erster Gedanke I, daß dieser an zwei eindeutigen conformations meines Prüfspitze Fragments liegen kann und bedeuten, daß eine Anpassung langsamere als die andere, aber, als ich meine Zündkapseln neu entwarf, damit sie nicht über einer Region mit Durchläufen der A/T Wiederholungen (bekannt, um verbiegende DNA zu verursachen) mich verstärken, erhalten das gleiche Resultat laufen läßt.
Hat jedermann, das sonst einer PCR Produktprüfspitze erfahren wird, der Durchläufe in zwei Bändern auf dem Polyacrylamid Gel Gel-verschieben, obwohl es wie eine Agarose-Gelelektrophorese des Bandes folgende gereinigt wurde?

Ich könnte mit etwas Hilfe hier von einem EMSA Experten wirklich tun. Ich kann eine Abbildung meines neuesten entwickelten Filmes auf Anfrage (ich möchte nicht herauf das Forum auf meinem allerersten Pfosten stauen) zur Verfügung stellen

Viel Dank jedermann, das mir hilft!

Canalba, Großbritannien

[admin]

Hallo Canalba,

Ich habe EMSAs fast meine ganze Forschung Lebensdauer getan! Geben Sie bitte den EMSA Film, wenn Sie möchten, ich könnte ihn zweifellos betrachten bekannt.

Ich habe viele EMSAs getan und aller, den ich sagen kann, ist ich haben gehabt dieses Problem vorher.
Dieses kann durch das folgende verursacht werden:

1) benutzen Sie DNAsen an irgendeinem Jobstep während der EMSA oder DNAsehemmnisse? diese können an Ihre DNA Reihenfolge binden und Ursache verschiebt auf das EMSA

2) kann Ihre DNA in seinem Betrieb ändern wegen der Änderungen im Salz/im Buffer/in der Reinigung und in anderen Jobsteps, die Sie nach der Ausführung das Agarosegel tun, um es zu überprüfen

3) gilt dieses normalerweise als Normal., was die Größe dieser Schicht ist? ist es auf dem Gel sehr niedrig? wenn es hoch ist, können Sie etwas Mühen haben erklärend, daß als es der Strecke einiger Ihrer Komplexe sich nähern kann.

Geben Sie bitte eine Antwort/oder einen Film bekannt, also können wir sehen, wie Sie tun!

Beifall!

[Canalba]

Hallo!

DANKE für das Antworten! Ich erhielt ein Bit gesorgt, weil, wie üblich, alles auf einem Stichtag ist! Sowieso wollte ~I Ihr Fragen reales schnelles beantworten, also können Sie erhalten einen besseren Handgriff auf, was ich tue.

> sind 1) Sie DNAsen an jedem möglichem Jobstep während der EMSA oder DNAsehemmnisse verwendend? diese können an Ihre DNA Reihenfolge binden und Ursache verschiebt auf das EMSA
Kein... benutze ich nicht DNAse- oder DNAsehemmnisse, gleichwohl ich ein Proteasehemmniscocktail benutze, das ich allen meinen Proben vor incubation/running hinzufüge. Es kann dieses sein, aber das doppelte Prüfspitze Band erscheint nicht für alle meine Prüfspitzen, nur 2 aus 5 von ihnen heraus, aber die zwei die Schlüsselfragmente sind (wie üblich)

2) kann Ihre DNA in seinem Betrieb ändern wegen der Änderungen im Salz/im Buffer/in der Reinigung und in anderen Jobsteps, die Sie nach der Ausführung das Agarosegel tun, um es zu überprüfen
Nach Agarosegelbetrieb führe ich eine normale Gelextraktion mit dem qiagen Installationssatz durch, gefolgt von der Eluierung im Wasser. Wieder sind alle meine Proben in der gleichen Methode behandelt worden, also, es sei denn es ein Phänomen tht kann einigen Bits von DNA geschehen ist und nicht andere, dann ich denken nicht, daß es dieses sein könnte....hmmm...

3) gilt dieses normalerweise als Normal., was die Größe dieser Schicht ist? ist es auf dem Gel sehr niedrig? wenn es hoch ist, können Sie etwas Mühen haben erklärend, daß als es der Strecke einiger Ihrer Komplexe sich nähern kann.
Dieses ist, wohin wir an das irritierende Teil gelangen - die Schicht ist ringsum ungefähr, wo meine Komplexe wahrscheinlich sind....a. ich auszusehen glauben, daß sie die Komplexe verdecken können

Jetzt habe ich ein Paar der Bilder für Sie angebracht, um zu sehen, was ich getan habe. Die erste Datei (EMSA001 S) zeigt das Gel mit meiner positiven Steuer-DNA, um Ihnen die Sortierung der Schicht zu zeigen, die ich erwarte (Wege 1-7). Ich denke, daß die Legende auf der Unterseite dieses auch erklärt. In der gleichen Abbildung sehen Sie, daß ein Fördererregionfragment, das ich habe nicht eine verbindliche Site weiß und folglich verschiebt, nicht, als erwartet (Lanes8-10) - die letzten drei Wege sind eine negative Steuerung, die nicht erwartet wird, um diese DNA an allen folglich zu binden keine Schicht (Wege 11-13). Guter Job bis jetzt, nach rechts?

Der zweite Film muß ich Sie zeigen (EMSA002 S) ist von mehr verdünnte Strecke der Proteinkonzentrationen zu meiner positiven Steuerung (Wege 1-7) wie ich herum mit Proteinkonzentrationen spielte, um die optimale Strecke zu versuchen und zu finden. Wege 8-10 enthalten die gleiche DNA Prüfspitze von den Wegen 8-10 in EMSA001s, das dieses Resultat bestätigt. Wege 11-13 sind von einem anderen Fördererregionfragment, dieses mal näeher an dem Anfangscodon meines Zielgens, die in diesen doppelten Bandeffekt laufen, dem ich mit kämpfe. Ich weiß, daß dieser Film etwas überbelichtet wird, aber ich denke, daß die Prüfspitze Stufe überhaupt so etwas über Wege 11-13 zeigend fallenläßt, daß dort binden können, aber ich kann nicht es wegen der Sekundärbänder sichtbar machen. Übrigens ist die DNA Prüfspitze in den Wegen 8-10 im Molekulargewicht zu der der Prüfspitze in den Wegen 11-13 sehr nah, also glaube ich, daß es das unterere Band ist, daß ich innen wirklich interessiert bin?

Ich bin für das TextÜbermaß in diesem Pfosten wirklich traurig, aber es ist so nett, ein sympatisches, knowledegable Ohr zu erhalten, das ich denke, daß ich weg auf eins ein wenig ging.

Vertiefung dort ist es... ich weiß nicht was, von bestellenoligos kurz zu tun, die die mutmaßliche verbindliche Site und wieder beginnen bedecken (nicht meine Liebling Option)...

Was denken Sie??

Ich erwarte Ihren Kommentar, aber werde vermutlich eine Antwort morgen bekanntgeben müssen, während ich das Labor für Reinigung verlassen muß..., das ich versuche, später anzumelden, um jeden möglichen Fall innen zu überprüfen.

Danke noch einmal während Ihrer Zeit...

Canalba, Großbritannien

EMSA002 s.jpg

EMSA001 s.jpg

[Canalba]

OoOops..In die Paragraphen früh, EMSA001s spricht das zweite Bild an und EMSA002s spricht das erste Bild an, wie Sie es im Pfosten sehen.

[admin]

Hmm... schönes EMSAs übrigens!

Ich sehe, daß sie große Bänder für Ihren Komplex sind und sie bei Zunahme der Proteinkonzentration sich erhöhen. Thats gut weil sein Dosisabhängiger. Ich sehe, daß Ihre freie Prüfspitze Abnahme ist, da das Protein weil seine bildenden Komplexe sich erhöht. Groß.

Nur Sache, die ich sehe, daß der sein kann, ist ein Problem 2 Sachen.

1) was die Größe Ihrer DNA HPR2 es ist, scheint sehr groß. Grosse DNA neigt, Probleme zu haben, während sie eingekerbt werden kann, supercoiled und Normal. Dieses gibt einige Bänder auf einem Gel (sogar Agarose) und würde dasselbe auf einem EMSA tun. Dieses ist eine Möglichkeit, da ich zwei höhere Bänder sehe. Eine Sache, die Sie tun konnten, während Sie mich schätzen sind Versuch ein die kleinere Prüfspitze erwähnten, zum der freien Prüfspitzen zu verhindern, die "auf die Oberseite" Ihrer komplizierten Bänder sichtbar gemacht wurden. Jedoch scheint sie, daß Sie viel höhere pmoles der heißen Prüfspitze für Ihre negative Steuerung benutzen können, die Ihnen Versuch jener Sekundärbänder gibt, um die gleichen pmoles zu benutzen (errechnen Sie die pmoles für die grössere DNA - Sie sollten weniger Prüfspitze für Ihre grössere DNA Prüfspitze benutzen). Dieses konnte Ihr Problem lösen!

2) stellen auch Sie Gebrauchkälte - der DNA Förderer sicher, der versucht wird und heraus Ihr Komplex konkurriert ist und wenn es tatsächlich Besondere, gesehen Sie, ist (Sie können dies bereits getan haben)

mehr bald kommen

[Canalba]

Thank you very much for the advice, admin!

I agree with your assessment about the HPR2 DNA. The probe is about 330bp whereas the positive ctrl probe (PHR1 promoter DNA) is about 180bp, sothere may be an issue there. I have ordered and repeated the EMSA with smaller probe fragments (~180-200) from my target gene promoter, but these too have the same double band effect.

I have not yet tried the cold promoter DNA vs positive control titration/competition experiment but I think that it will soon have to be done. I just wanted to try everything I could to get a proper band shift with my promoters themselves, as I have previously been advised that this is stronger data? Or is it just as convincing with the competition study? I wonder if the protein will stick to any DNA if there is enough of it around?

I'm also considering ordering oligos (~20-30mer) encoding the sequence across the potential binding site in the promoter region and using these as probes. This will give rise to afew questions...
1)Could you give me any advice about this type of experiment?
2)i.e. Do you think it may get rid of the multiple conformation/band effect because they are so small?
3)Have you ever done this and has it worked for you?
4)Can I label it in the same way, and how do I purify probe of only 30 nucleotides? (most commerical DNA purification systems seem to cut off around 15-200bp...
I strongly feel that these binding sites will turn out to be much weaker than my positive control so the range of protein concentrations necessary may be higher to see the same shift...?

Looking forward to your next post...

Thanks again!

Canalba, UK

[admin]

Hey again!
you could easily order a few oligos or create restriction site digestion fragments and label them... use these then as probes after purification in case of restriction enzyme cuts or just anneal the two oligos together and then label them

yes smaller probes should remove the higher bands you see on EMSA. although I mentioned you should use less of it ( I think you are using too much pmoles maybe of the larger probe)

to purify use G-25 sephadex for small probes although you will not need to purify oligos as they are already pure

Cheers!

[juvescott]

Thanks for posting this problem and possible solutions. If I may, how things are progressing with your assays?

I have been having similar problems with equal intensity secondary bands in negative controls. I went through addition of each binding buffer component to identify a potential contaminant with binding capability when dna and water exhibited the extra band. The DNA is relatively long (278bp) and AT rich, so i suspect that it is due to bending however the band is running near my bound 26 kD protein shift (not exact). Do we expect a bent DNA to shift this much? Can we eliminate this (not using shorter fragments is not really an option now)? Why doesn't all of the DNA run the same as the 'bent' DNA?

Thanks in advance!!!