Pcr-Hemmung durch DNA

[Dionisia]

HALLO ALLE!

Ich habe ein großes pcr-Problem. Ich versuche, einen pcr unter Verwendung Plasmid DNA zu leiten, die ich unter Verwendung eines Qiagen Midi Installationssatzes reinigte.

Ich benutze diese DNA, um eine Standardkurve für qRT-PCR zu bilden.

Meine Standardkurve für den qRT-PCR besteht aus einer fünfpunktigen Serienverdünnung, die von 10ng zu 0.01ng von DNA in einem Datenträger der Reaktion 25uL reicht.

Mein Problem ist, dass ich keine Verstärkung mit den höchsten zwei Punkten auf der Kurve sehe, die die Punkte 10ng und 1ng ist.

Ich denke nicht, dass meine Reagenzien begrenzen, weil ich die PCR-Reaktion bei höheren Konzentrationen als die auf meiner Kurve optimierte. Etwas hemmt meine PCR-Verstärkung in den höheren DNA-Konzentrationen und sogar schlug ein Qiagen Repräsentant vor, dass meine DNA PCR hemmen kann.
Hat jemand irgendwelche Ideen?
Dank für everyones hilft im Voraus
Beifall

[postdock]

He dort,

welchen Eluierungbuffer benutzten Sie, der Qiagen EB Buffer?

Es gibt Salze und EDTA in Qiagen EB, das die PCR-Mühe verursachen kann.

Auch vergessen Sie nicht, dass es Restäthanol von Ihrem miniprep geben könnte, das die Leistungsfähigkeit der PCR-Reaktion hemmen kann.