Mühe Re-PCR

[Jachthafen Ntika]

Hallo jeder.

Ich versuche, ein Gen zu verstärken, und gleichzeitig Punktveränderungen vorzustellen, um die Verdauung mit einem spezifischen Enzym des Interesses zu aktivieren, mit dem Endziel, mein Gen in ein spezifisches Plasmid zu klonen.

Da die Punktveränderungen ich benötige, 5 sind (könnte eine passendere Site nicht finden, um Zündkapseln, Ursache zu konzipieren, die ich im Feld mit ATG der ZielPlasmide bleiben muss), ich zwei Vorwärtszündkapseln konzipierte, die ersten mit 3 Punktveränderungen und das zweite, das erste Vorwärts abgleichend, und die restlichen zwei Veränderungen vorstellend. Ich benutze die gleiche Rückzündkapsel, um beide meine zusammenzupassen nachschicke.

Das erste bearbeitete gerade feine der Paare (Vorwärtszündkapsel A und Rückzündkapsel), erhielt ich das Produkt, das ich wünschte, leicht und ziemlich frei (nachdem ich das Profil fine-tuning, erhielt ich nur ein Band, das rechte). Jedoch während des Re-PCR unter Verwendung des vorhergehenden resultierenden Produktes als Schablone und Anwendung der zweiten Paare der Zündkapseln (Vorwärtszündkapsel B und Rückzündkapsel), erhalte ich 2 Bänder, alle, die extrem intensiv sind und alle, die ziemlich niedriger als erwartete sind. Mit höherer Konzentration von MgCl2, erhielt ich auch ein drittes Band (gewünschte), aber es ist extrem schwach. Ich kann nicht sicher sein, wenn es auch irgendein Teil der Schablone DNA ist, die reagierte nicht mit den Zündkapseln…

Die Mengenschablone für das rePCR ist 1ul.

Die Ausglühentemperatur für beide Paare Zündkapseln ist 64C, aber ich bin oben bis 66 und noch, erste Paararbeiten, tue an zweiter Stelle nicht gegangen.

Auch eine schnelle Anmerkung: Die Veränderungen durch wechselnde Methoden vorzustellen oder das Auswählen eines anderen Enzyms für die Klonenprozedur ist nicht eine Option.

Bitte sind alle mögliche Anhaltspunkte und Vorschläge meistens willkommen.

Traurig für den langen Pfosten und thanx im Voraus.

[kmunson779]

Bin ich richtig lesend, dass Sie 1 UL Ihres ersten PCR-Produktes als Schablone für Ihre zweite Reaktion benutzten? Dieses scheint wie ein schreckliches Lot DNA mir.

Wie reinigten Sie Ihre DNA zwischen den zwei PCR-Jobstepps? Wie viel DNA (in Molen oder Gramm ausgedrückt) fügen Sie Ihrer zweiten PCR-Reaktion hinzu?

Wieviele Schleifen lassen Sie für die zwei Reaktionen laufen?

Vor dem Verfahren, ich weiß, Sie sagen, Sie keine wechselnden Methoden anwenden können, aber sie das Stumpfende wert sein kann, welches das erste Produkt klont, um zu überprüfen, dass sie die korrekten Veränderungen hat.

Sie kann eine andere Rück, zündkapsel außerhalb der Region zu konzipieren auch wert sein, die Sie für die erste PCR-Reaktion verstärken möchten, Probleme zu vermeiden Sie das Versuchen haben können Re-Haupt mit der gleichen Zündkapsel.

[oBWhat]

Ja normalerweise verdünnen wir das 1uL der PCR-Reaktion in 10ul des gereinigten Wassers und verwenden dann 1ul von dem für einen anderen PCR, da die PCR-Mischung Ihre Reaktion außerdem hemmen kann.

[Jachthafen Ntika]

Ursprünglich bekannt gegeben durch kmunson779

Bin ich richtig lesend, dass Sie 1 UL Ihres ersten PCR-Produktes als Schablone für Ihre zweite Reaktion benutzten? Dieses scheint wie ein schreckliches Lot DNA mir.

Wie reinigten Sie Ihre DNA zwischen den zwei PCR-Jobstepps? Wie viel DNA (in Molen oder Gramm ausgedrückt) fügen Sie Ihrer zweiten PCR-Reaktion hinzu?

Wieviele Schleifen lassen Sie für die zwei Reaktionen laufen?

Vor dem Verfahren, ich weiß, Sie sagen, Sie keine wechselnden Methoden anwenden können, aber sie das Stumpfende wert sein kann, welches das erste Produkt klont, um zu überprüfen, dass sie die korrekten Veränderungen hat.

Sie kann eine andere Rück, zündkapsel außerhalb der Region zu konzipieren auch wert sein, die Sie für die erste PCR-Reaktion verstärken möchten, Probleme zu vermeiden Sie das Versuchen haben können Re-Haupt mit der gleichen Zündkapsel.

Vor dem Verfahren bis zweite gut reinigte ich nicht wirklich das erste PCR-Produkt, mein Band war zu verursachen sehr frei, und ich hatte keine anderen Produkte oder Schlupfstelle. Jedoch plane ich, noch einmal zu versuchen und die Schablone für den zweiten PCR durch Gelextraktion, gerade im Fall zu extrahieren wird ein non-visible Band außerdem verstärkt. Die Schablone, die ich für den zweiten PCR benutze, ist ng ungefähr 10-30. Ich lasse 40 Schleifen laufen.

Leider habe ich nicht Zeit neu zu entwerfen und Ordnungszündkapseln, Ursache, die ich meine Diplomarbeit an September darstellen muss, und ich habe noch ein zweites Klonenteil (mit dem MARKIERUNGSFAHNEN-Gen) und dann das vollständige Gen (Markierungsfahne-Anfangsgen) muss in einen gegebenen Ausdruckvektor geklont werden, tue eine Lokalisierung der großen Skala und gehe dann in vivo. Mein Zeitplan ist!! extrem fest! Dieser Zeitmangel, zusätzlich zur armen Finanzierung des Projektes führt zu meine Unfähigkeit, alternative Methoden auszuüben. Stellen Sie sich dass ich haben nicht sogar die Fähigkeit, Installationssätze zu benutzen vor, ich alle meine Lokalisierungen die altmodische Methode tue, die extrem Zeit raubend ist.

Sowieso vielen Dank für Ihre Antwort, versuche ich auch, mein erstes Produkt-1:10 zu verdünnen und dieses, als Schablone außerdem zu verwenden zu versuchen, wie oBWhat (danke auch), vorschlägt, und sehe, wie es geht…