Gelelektrophoresemühe

[hsip_15]

Lieb alle,

In meinem ersten Versuch mit Elektrophorese, benutzte ich TAE Buffer, wie empfohlen in Maniatis, 2001, die aus dem 40mM Tris-Azetat, pH 7.0 und 0.5M das EDTA pH8.0. dieser Versuch bestanden, konnte ich alle mögliche Bänder einschließlich die DNA Strichleiter (Fermentas) erreichen nicht.

Die nächsten Versuche, versuchte ich, TE Buffer, wie durch Kado und Liu empfohlen, die auf der Literatur von Mickel basierten, Arena und Bauer zu verwenden (physikalische Eigenschaften und Gelelektrophoreseverhalten des R12-derived Plasmids DNAs, der Nukleinsäure-Forschung) der aus dem 0.04M Tris-Azetat bestand und 2mM EDTA, pH 8.1. Der neueste Versuch, hatte ich schwache Bänder für meine Proben der Plasmide und stärkere Bänder zur Steuerung (pUC19) jedoch die Strichleiter stellten nicht an allen dar, obgleich ich die Strichleiter in den Vertiefungen an beiden Enden des Gels geladen habe. Warum ist es so? Was könnte falsch gewesen sein?

Eine andere Frage ist, unter UV-Ablichtung, Hälfte des Gels (das negative Ende mit Beispielvertiefungen) scheint, als die andere Hälfte heller zu sein. Es gibt einen freien Unterschied zwischen beiden Enden irgendwo mitten in dem Gel. Warum ist es so?

Dankt alot.

[kmunson779]

Die erste Sache, die ich tun würde, würde, Ihr befleckendes Protokoll zu überprüfen sein. Benutzen Sie Äthidiumbromid oder noch etwas? Fügen Sie Ihren Fleck dem Gel, den Proben hinzu, oder beflecken nach dem triebwerklauf?

Wenn Sie EtBr verwenden und es dem Gel hinzufügen, sehen Sie dieses Hälfte-befleckte Hälfte-nicht Gel pattern, weil das EtBr in Richtung zur Kathode fortzieht (das Ende des Gels, in dem Ihre Beispielvertiefungen sind-). Sie können dieses regeln, indem Sie nach dem triebwerklauf beflecken oder indem Sie das Gel destaining (waschend im Wasser oder im Buffer auf einem Quirl für 5-10 Minuten nach dem Durchlauf).

Wenn dieses nicht der Fall ist, sollten Sie die Birnen auf Ihrem UV-TRANSILLUMINATOR überprüfen, um zu sehen, wenn man heraus gebrannt wird. Dieses verursacht dunkle Regionen auf dem transilluminator.

Machen Sie durch Auge sichtbar oder benutzen eine Kamera irgendeiner Sortierung (Polaroid oder CCD)? Sie benötigen viel mehr DNA, durch Auge als mit einer Kamera sichtbar zu machen. Möglicherweise hat Ihre Probe mehr DNA als Ihre Strichleiter, also können Sie die Probe und nicht die Strichleiter sehen?

Ich bin überrascht, daß Sie nicht niemand in Ihrem Labor haben, das Elektrophorese vorher durchgeführt hat, die Ihnen helfen kann Fehler zu suchen. Jemand, die genau überwachen kann, was Sie tun, ist eine enorme Hilfe, in heraus darstellen, wohin Sie falsch gehen.

[hsip_15]

Lieber Kmunson779,

Dank wieder für Ihre sofortige Antwort.

In erster Linie fügte ich EtBr meinen Gelen hinzu. So ist Ihre Antwort von der großen Hilfe zu mir.

Dann visulized ich das Gel mit beiden, Kamera und auch durch Auge unter dem UV-TRANSILLUMINATOR. Beide zeigten die gleichen Resultate.

Ich habe versucht, zu fragen einige, die Genetik tun und Mikrobiologie aktuell und es scheinen, daß sie von den Gründen unsicher sind.

Dankt Million.

[kmunson779]

Wenn Sie Zugriff zu einer Kamera haben, würde ich das Versuchen einer viel längeren Berührung Zeit, zu sehen vorschlagen, wenn Sie alles an allen auf Ihrem Gel sehen können.

Wenn Sie einen hohen Leuchtstoffhintergrund haben, kann der Versuch, der das Gel also Sie destaining ist, Ihre Bänder besser sehen.

Wie versuchen Sie eine nagelneue Aliquote der Strichleiter -- diese sollte eine große positive Steuerung sein, weil Sie wissen, genau wieviel DNA Sie hinzufügen, Sie daß wissen, sie ist sauber und was sie schauen sollte. Wenn Sie ein älteres Gefäß benutzen, konnten Sie die DNAseverschmutzung oder -noch etwas haben, die herauf die Probe mucking sind.